黏著斑激酶在2 型糖尿病大鼠腎組織中的表達變化及意義*

李 霜， 王圓圓， 劉麗榮， 石 磊， 石明雋， 肖 瑛， 張國忠， 郭 兵

(貴陽醫學院病理生理學教研室，貴州 貴陽550004)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)作為一組遺傳和環境相互作用引起的代謝綜合征，患病率正逐年上升。糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)已成為導致終末期腎衰竭及DM 病死率增加的重要原因，但DN 的發生機制仍未充分闡明。近來研究表明，黏著斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)作為一種非受體型蛋白酪氨酸激酶，在肝纖維化及心肌纖維化組織中表達增多和磷酸化增強，而FAK 的內源性抑制因子FRNK(FAK-related non-kinase)的表達卻減少，提示FAK 在臟器纖維化過程中可能發揮重要作用［1-3］。但在2 型糖尿病(the type 2 diabetes mellitus，T2DM)中，腎組織中FAK 蛋白的表達變化及意義仍不清楚。我們前期研究發現，DM 大鼠血糖、血肌酐、血甘油三酯、血總膽固醇及24 h 尿蛋白量較對照組均顯著升高，但血清胰島素水平與對照組相比無明顯差異;HE 染色下見正常組腎小球形態完整，輪廓清晰，腎小管未見異常;DM 16 周組大鼠腎小球體積增大和系膜基質增多，腎小管管腔擴張，上皮細胞脫落，部分腎小管基底膜不完整，間質可見炎癥細胞浸潤［4］。為此，本研究采用高脂高糖飲食加小劑量鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)腹腔注射的方法，復制大鼠T2DM 模型，并觀察FAK 在T2DM 大鼠腎組織中的動態變化，探討FAK 在DN 發病機制中的作用及可能機制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 動物 SD 大鼠30 只，雄性，體重(200 ±20)g，由貴陽醫學院實驗動物中心提供，清潔級。

1.2 主要試劑 STZ 購自Sigma;纖維連接蛋白(fibronectin，FN)兔多克隆抗體、FAK 兔多克隆抗體、轉化生長因子β1(transforming growth factor beta 1，TGF-β1)兔多克隆抗體和細胞外信號調節激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2)兔多克隆抗體購自武漢博士德公司;p-FAK(Tyr397)兔多克隆抗體購自博奧森生物技術有限公司;p-ERK1/2 兔多克隆抗體購自Santa Cruz;總RNA 提取試劑盒、2 ×Taq PCR MasterMix、1 500 bp DNA Marker 購自天根生化科技有限公司;RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas);胰島素測定試劑盒購自天津九鼎生物醫學工程有限公司;考馬斯亮藍測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所;血糖、血肌酐、甘油三酯和總膽固醇測定試劑盒購自四川邁克科技有限公司;FAK 及β-actin 引物均由大連寶生物工程技術有限公司合成。兩步法免疫組化檢測試劑購自北京中杉金橋生物技術有限公司;Western 印跡用PVDF 膜和Whatman 3 mm 濾紙購自Millipor;超敏ECL 化學發光試劑盒購自碧云天生物研究所。

1.3 主要器材 強生穩步倍加型血糖儀(強生公司)，超低溫冰箱(Sanyo)，高速低溫離心機(Beckman)，電泳系統及電轉移裝置(Amersham)，凝膠成像系統(Bio-Rad)，梯度PCR 擴增儀(Bio-Rad)，超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司)，瞬時離心機(上海捷瑞公司)，Olympus 圖象采集系統(Olympus)。

2 方法

2.1 糖尿病模型的制備和分組 將SD 大鼠隨機分成正常對照組(NC，n =6)和高脂高糖組(HG，n =24)。大鼠適應性飼養1 周后，HG 組以高脂高糖飼料喂養，飼料組成如下:67%常規飼料、20% 蔗糖、10%豬油、2%膽固醇、1%蛋黃。喂養12 周時，稱體重，測空腹血糖，尾動脈取血測血清胰島素水平;HG組飼養12 周后又隨機分為高脂高糖對照組(HC，n=6)和糖尿病組(DM，n =18)，DM 組大鼠按30 mg/kg劑量腹腔注射STZ (以pH 4.5、0.01 mol/L 無菌檸檬酸緩沖液配成1%濃度)。72 h 后測空腹血糖，血糖≥13.8 mmol/L 作為2 型糖尿病大鼠，18 只大鼠全部建模成功，成模大鼠隨機分為糖尿病8 周組(DM8，n =6)、12 周組(DM12，n =6)和16 周組(DM16，n =6)。NC 組以常規飼料喂養，各組大鼠均自由飲水。

2.2 動物標本的采集 分別于實驗的第20 周、24周和28 周(即糖尿病8、12 和16 周)處死DM8、DM12 和DM16 各組大鼠，于第28 周處死NC 和HC組大鼠。處死前1 d 代謝籠收集24 h 尿液，記錄尿量。禁食6 ～8 h，麻醉后稱體重，股動脈放血、收集血液，4 ℃離心，分離血清，-20 ℃保存;處死大鼠，開腹取腎臟，稱重，一側腎臟固定于4%多聚甲醛供制作石蠟切片用，另一側腎臟于-80 ℃保存供Western blotting 和RT-PCR 檢測。

2.3 免疫組化染色 采用免疫組化SP 法檢測TGFβ1(1 ∶50)、FN(1 ∶100)、FAK(1 ∶50)、ERK1/2(1∶100)和p-ERK1/2(1∶100)在各組大鼠腎組織的分布和表達，PBS 作為陰性對照，DAB 顯色，蘇木素復染。蛋白陽性表達計數方法參考本實驗室既往的研究［6］，計數10 個高倍視野(400 倍)，取均值。

2.4 Western blotting 檢測 取-80 ℃保存的各組大鼠腎皮質，每組100 mg，分別加入組織蛋白提取液后勻漿、離心、取上清，用BCA 試劑盒(碧云天)測定各組蛋白質濃度，按所測得濃度計算每泳道所需體積，加入加樣緩沖液煮沸10 min。經10% SDSPAGE 凝膠電泳分離，再轉移至PVDF 膜上，脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入FAK、p-FAK (Tyr397)或β-actinⅠ抗，工作濃度分別為1∶150、1∶100 和1∶300，4℃孵育過夜。次日用TBST 洗膜后，加入相應的辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗(濃度均為1∶5 000)室溫孵育1 h，ECL 化學發光試劑，暗室曝光，Bio-Rad 凝膠成像系統掃描膠片，Quantity One 軟件分析各條帶的面積和灰度值，兩者乘積為積分灰度值，每個樣本重復操作3 次。以同一張膠上 FAK 和 p-FAK(Tyr397)與相應的β-actin 條帶所測積分灰度值的比值，即相對積分灰度值對FAK 和p-FAK (Tyr397)蛋白進行半定量。

2.5 RT-PCR 檢測腎組織FAK mRNA 的表達

TRIzol一步法提取大鼠腎皮質的總RNA，核酸蛋白儀測RNA 的濃度和純度(A260/A280均在1.8 ～2.0 之間)，取4 μg 腎組織總RNA 按RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit 說明進行逆轉錄，合成cDNA，-20 ℃保存備用。以cDNA 為模板進行FAK和β-actin(作為內參照)共同擴增。FAK 上游引物5'-ACTTGGACGCTGTATTGGAG-3'，下游引物5'-CCTGTTGCCTTTCTGGATAC-3'，產物985 bp;β-actin 上游引物5’-GAAATCGTGCGTGACATTAAG-3’，下游引物5’-CTAGAAGCATTTGCGGTGGA-3’，產物490 bp。擴增條件:94 ℃預變性5 min，進入循環:94 ℃45 s，59.2 ℃45 s，72 ℃60 s，35 個循環后，再72 ℃10 min。反應產物做1. 5% 瓊脂糖凝膠電泳，Bio-Rad 凝膠成像系統掃描，應用Quantity One 軟件將各FAK 條帶的吸光度值與β-actin 條帶吸光度值的比值作為FAK 相對表達水平參數，進行半定量分析。

3 統計學處理

數據以均數±標準差(mean ± SD )表示，采用SPSS19.0 軟件處理，多組數據差異比較用ANOVA分析，兩組間數據相關性比較用直線相關分析。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 大鼠一般情況

實驗過程中，糖尿病大鼠呈現明顯多尿、多飲、多食，生長緩慢，血糖維持在較高水平(≥13. 8 mmol/L)。單純高脂高糖組大鼠無上述表現，體重增長顯著，血糖無明顯升高。

2 免疫組化結果

各組大鼠腎小管上皮細胞胞漿均可見FAK 蛋白表達，DM12 和DM16 組FAK 蛋白表達較NC 組和HC 組顯著增加(P ＜0.05)，見圖1。

TGF-β1在NC 和HC 組腎組織幾乎無表達。DM8 組腎小管上皮細胞TGF-β1表達較NC 組和HC組顯著增多(P ＜0.05)，表達隨病程進展明顯升高且持續高表達至DM16 組，見圖1。

NC 和HC 組ERK1/2 在腎小管上皮細胞胞漿內表達，且有少量p-ERK1/2 表達，并可見核表達。隨糖尿病進展ERK1/2 表達無明顯增加，但DM8 組p-ERK1/2 在腎小管上皮細胞胞漿內的表達較NC 組和HC 組顯著增多(P ＜0.05)，且核內表達也明顯增多，并持續高表達到糖尿病形成后16 周，見圖1。

各組大鼠腎組織中FN 沿腎小管基底膜呈線性分布。在NC 和HC 組腎組織中，FN 可見少量表達。DM8 組FN 表達增多且較NC 組和HC 組明顯增加(P ＜0.05)，隨病程發展逐漸增多，至DM16 組達到高峰，見圖1。

3 Western blotting 結果

NC 組和HC 組大鼠腎組織有FAK 總蛋白和p-FAK(Tyr397)表達，兩組無顯著差異，DM8 組FAK和p-FAK(Tyr397)表達無明顯增加(P ＞0. 05)，DM12 組和DM16 組FAK 和p-FAK(Tyr397)表達較NC 組、HC 組及DM8 組顯著增多(P ＜0.05)，且p-FAK(Tyr397)與FAK 總蛋白表達趨勢一致，見圖2。

4 RT-PCR 結果

NC 和HC 組有FAK mRNA 表達，DM8 組無明顯增加，DM12 和DM16 組FAK mRNA 比NC、HC 組及DM8 組表達明顯增加(P ＜0.05)，見圖3。

5 相關性分析

腎皮質中FAK 與TGF-β1、p-ERK1/2、FN 陽性蛋白表達隨DM 病情進展呈增多趨勢，相關性分析結果顯示，DM12 和DM16 組FAK 與TGF-β1、p-ERK1/2、FN 呈顯著正相關(r 值分別為0. 792、0. 558 和0.593，P ＜0.01)。

Figure 1. Expression of FAK，TGF-β1，ERK1/2，p-ERK1/2 and FN proteins in renal tubular cells of rats in each group (immunohistochemical staining，×400). Mean±SD. * P ＜0.05 vs NC group;△P ＜0.05 vs HC group.圖1 FAK、TGF-β1、ERK1/2、p-ERK1/2 和FN 蛋白在各組大鼠腎小管上皮細胞中的表達情況

Figure 2. The expression levels of total FAK and p-FAK(Tyr397)in rat kidney tissues in each group detected by Western blotting. Mean ± SD. n = 6. * P ＜0.05 vs NC group;△P ＜0.05 vs HC group.圖2 Western blotting 檢測總FAK 和p-FAK(Tyr397)蛋白在各組大鼠腎組織中的表達

Figure 3. Expression of FAK mRNA in rat renal cortex in each group detected by RT-PCR. Mean ± SD. n =6. * P ＜0.05 vs NC group;△P ＜0.05 vs HC group.圖3 RT-PCR 檢測各組大鼠腎皮質FAK mRNA 的表達

討 論

本實驗采用高脂高糖飲食加小劑量STZ 的方法復制2 型糖尿病動物模型，DN 發展為慢性腎衰竭的最終通路是腎小球硬化及腎小管-間質纖維化，但其發病機制尚未充分闡明。TGF-β1是目前已知的致腎纖維化作用最強的多肽因子之一，它能誘導腎臟固有細胞表型轉化及促進胞外基質(extracellular matrix，ECM)增生，在腎小管-間質纖維化進行性發展中起關鍵作用。TGF-β1主要通過激活Smad 通路發揮其致纖維化效應［5-6］，同時也可激活其它非Smad通路來促進纖維化病變的發生發展。黏著斑激酶FAK 是一種胞質非受體酪氨酸激酶，有多個酪氨酸磷酸化位點，其中Tyr397 是其自主磷酸化位點，不同的酪氨酸位點的磷酸化可為其它信號轉導分子提供位點［7］。體外研究表明，TGF-β1刺激人腎小管上皮細胞HK-2 能呈時間依賴性促進FAK 總蛋白及p-FAK(Tyr397)的表達，且p-FAK(Tyr397)表達趨勢與FAK 相同［8-9］，Shikano 等［10］也發現1 型糖尿病大鼠腎小球內磷酸化FAK 與樁蛋白(paxillin，PL)表達增多，胰島素治療后，腎小球FAK 與PL 的表達明顯減少，提示FAK 可能與糖尿病的發病有關。本研究結果顯示，T2DM 大鼠成模后12 周腎小管上皮細胞中FAK 蛋白及mRNA 表達增加(P ＜0.05)且持續到16 周，p-FAK(Tyr397)表達趨勢與總FAK 一致，同時DM12、DM16 組的腎小管上皮細胞中FAK 蛋白表達量與TGF-β1呈顯著正相關(P ＜0.01)，提示FAK 可能參與TGF-β1致腎小管間質纖維化的過程。進一步研究發現，FAK 可能參與TGF-β1介導的腎小管上皮細胞向間質細胞轉分化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的發生和發展［9］，促進α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)表達增多、E-鈣粘蛋白(E-cadherin)減少，使腎小管上皮細胞轉分化成為肌成纖維細胞從而介導腎間質纖維化。Ding等［11］用TGF-β1刺激人及大鼠肺成纖維細胞后促使FAK、p-FAK(Tyr397)和α-SMA 表達增多，而用FAK的內源性抑制因子FRNK 轉染肺成纖維細胞后，α-SMA 的蛋白表達量下降了約85%。本研究結果亦發現T2DM 大鼠腎組織的FAK 隨著病程進展在蛋白和轉錄水平表達均明顯增多的同時，腎間質ECM 主要成分FN 表達顯著增多，提示在DN 病變過程中FAK 的表達增加，促進了TGF-β1介導腎間質ECM的沉積，使DN 的纖維化病變加重。

但TGF-β1究竟通過何種機制誘導了FAK 表達增加，目前尚不清楚。Walsh 等［12］用TGF-β1刺激IEC-6 細胞(大鼠空腸細胞)和Caco-2BBE 細胞(人結腸細胞)導致FAK 及p-FAK(Tyr397)的蛋白表達量增多后，運用siRNA 技術降低了Smad2 蛋白的表達，使TGF-β1促進FAK 蛋白總量表達增多的效應被阻斷。同樣使用p38 MAPK siRNA 降低p38MAPK蛋白的表達也抑制了TGF-β1誘導的FAK 蛋白總量表達增多的效應。這提示Smad 和p38 MAPK 信號通路在TGF-β1誘導的FAK 蛋白總量增加的過程中起到很重要的作用。而在2 種細胞類型的培養液中同時添加p38 MAPK 阻滯劑SB203580，Smad2/3 依然能被TGF-β1最大程度活化，提示p38 MAPK 并不是Smad 信號通路的上游分子，p38 MAPK 與Smad信號通路是獨立的。推測TGF-β1通過p38 MAPK與Smad 信號通路促進FAK 蛋白的表達。有研究表明，當FAK 活化后可進入Ras 途徑激活位于胞漿內的ERK1/2，被活化的ERK1/2(p-ERK1/2)迅速進入胞核內，可以使轉錄因子如AP-1 磷酸化進而增強FN 基因的轉錄活性，最終導致FN 的產生［13-14］。在本實驗中，隨著FAK 及其磷酸化水平的上調，雖然ERK1/2 總蛋白在NC、HC 和DM 各組大鼠腎小管上皮細胞中的表達無顯著差異，但DM 各組大鼠腎組織中p-ERK1/2 的表達卻顯著升高(P ＜0.01)，進一步證實DM 腎組織中的ERK1/2 的活性明顯高于正常對照組，但蛋白含量無明顯變化［15］。DM 腎小管上皮細胞中p-ERK1/2 表達增多，可使AP-1 活化繼而誘導腎間質FN 的生成增多，增加ECM 成分的表達;同時由于T2DM 大鼠腎組織中p-ERK1/2 與TGF-β1呈顯著正相關(P ＜0. 01)，提示p-ERK1/2還可增強TGF-β1/Smads 信號通路的活性，參與了TGF-β1介導的腎間質纖維化的發病［16］。

總之，本研究表明，在2 型糖尿病時，FAK 可能作為TGF-β1的下游分子之一表達增多以及被活化，并通過活化ERK1/2 使FN 表達增多，從而參與了糖尿病腎病的發生發展。然而在DN 的發展過程中，FAK 表達的上調受哪些因素的影響以及TGF-β1究竟通過何種機制誘導FAK 表達增加，有待進一步研究證實。

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