慢病毒介導的降鈣素基因相關肽轉染對大鼠骨髓間充質干細胞內皮分化的影響*

龍仙萍， 汪 松， 趙然尊， 石 蓓△， 敖竹君

(遵義醫學院第一附屬醫院1心內科，2急診科，貴州 遵義563003;3曼尼托巴大學，加拿大曼尼托巴省溫尼伯市R3E 0J9)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是心肌缺血性壞死，為在冠狀動脈病變的基礎上發生的冠脈血供急劇減少或中斷，使相應心肌持久地急性缺血導致心肌壞死。經皮冠狀動脈介入治療(percutaneous coronary intervention，PCI)雖可以挽救部分頻臨壞死的心肌細胞，但對長期血供不足的心肌無明顯的作用。盡早恢復梗死區血液供應是預防梗死后心功能衰竭，改善患者預后的關鍵。骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)具有多向分化潛能，多項研究顯示MSCs 移植后促進梗死交界區毛細血管形成，從而改善梗死后心功能［1-2］。我們前期研究也顯示MSCs 移植于心肌梗死家兔可促進梗死交界區毛細血管密度形成，使梗死面積縮小，心功能得到改善［3］。為了進一步優化MSCs 的移植作用，本課題前期應用受體活性修飾蛋白1(receptor activity-modifying protein 1，RAMP1)修飾的MSCs 移植于心肌梗死后頸動脈球囊損傷兔模型后，觀察到RAMP1 修飾的MSCs 移植較單純MSCs 移植更能促進梗死交界區的毛細血管密度形成增加，更能改善梗死后心功能［4］。而RAMP1 是降鈣素基因相關肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)的關鍵調節肽，RAMP1 移植使CGRP 效應增強，這說明CGRP 對心血管的修復具有一定的作用。CGRP 是人體內含量最豐富的神經肽，對心血管系統具有保護作用。研究發現CGRP 可促進內皮細胞增殖［5］，還可以促進人臍靜脈內皮細胞合成和分泌一氧化氮(nitric oxide，NO)，改善內皮的功能。那么CGRP 對MSCs 有無作用呢?為了觀察CGRP 的作用，本文利用慢病毒介導CGRP 基因轉染MSCs，觀察CGRP 對MSCs內皮分化方面的作用及意義，以探討CGRP 是否促進心肌梗死后的血管再生。

材 料 和 方 法

1 材料

10 只大鼠作為種子細胞的來源，雌雄不限，體重(150.0 ±0.1)g，鼠齡2 ～3 月，購自遵義醫學院實驗動物中心。實驗分為 CGRP 轉染 MSCs 組(CGRP)、CGRP 轉染MSCs + CGRP 受體拮抗劑組(CGRP+ CGRP8-37)及未經轉染的對照組。前期實驗應用空慢病毒載體和PBS 轉染MSCs 后，觀察到兩者對細胞增殖活性及細胞生物學特征無明顯影響，故本實驗直接應用PBS 轉染MSCs 作為對照。實驗試劑:MaxGelTM細胞外基質(extracellular matrix，ECM)和CGRP 受體拮抗劑CGRP8-37(Sigma);抗體(武漢博士德);基礎培養基:DMEM(Gibco);條件培養基:M199 含10%胎牛血清(PAA)、50 μg/L 血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、5 μg/L 堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、2 μg/L 胰島素樣生長因子Ⅰ(insulin-like growth factor I，IGF-I)、1 × 104U/L 的肝素、0.2%牛腦提取物、1 ×105U/L 青霉素和100 mg/L 鏈霉素(Sigma)。

2 方法

2.1 大鼠MSCs 細胞的分離純化和培養擴增 采用密度梯度離心法分離純化大鼠MSCs［3-5］。48 h 后換液，約10 ～14 d 細胞接近融合時按1∶3 傳代，標記為第1 代(P1)，以后反復傳代擴增。

2.2 攜帶CGRP 基因慢病毒載體的構建 重組慢病毒Lenti-GFP-CGRP 和Lenti-GFP 均由上海英為信生物公司構建，本實驗用293 細胞擴增，-70 ℃保存備用。

2.3 ELISA 檢測CGRP 表達 收集病毒轉染后1 d、2 d 和3 d 的細胞上清液，加入含Ⅰ抗的96 孔板，每孔加入100 μL 酶標抗體工作液，封板，37 ℃孵育30 min，洗板后加底物工作液100 μL，置37 ℃避光反應15 min 后加入100 μL 終止液混勻，30 min 內用酶標儀測得450 nm 吸光度(A)，以標準品2 000、1 000、500、250、125、62.5、31.25、0 ng/L A 值為縱坐標，根據樣品A 值在該曲線圖上查出CGRP 的含量。

2.4 大鼠MSCs 轉染CGRP 對細胞內皮分化的影響

同源的P3 大鼠MSCs 用胰酶消化，按5 ×103cells/well 接種于預先放好細胞爬片的24 孔板，完全培養基過夜。12 h 后吸盡培養基，PBS 洗2 次，轉染組加人400 particles/cell Lenti-CGRP，CGRP +CGRP8-37組在給予Lenti -CGRP 前30 min 加入0. 1 μmol/L CGRP 受體拮抗劑CGRP8-37，對照組用PBS 代替。轉染后1 d、2 d、3 d 和4 d 在熒光顯微鏡下計數綠色熒光細胞并計算轉染率。每3 d 換液1 次，7 d 后取出爬片，進行CD31 和Ⅷ因子相關抗原免疫細胞化學染色(SP 法)。

采用同源的P3 大鼠MSCs 用胰酶消化，按2 ×104cells/well 接種于24 孔板，完全培養基過夜12 h后吸盡培養基，實驗分組和步驟如上，分別在誘導后第1 d、2 d、3 d、5 d、7 d 和9 d 取出爬片進行細胞計數，其余細胞每3 d 換液1 次。根據細胞計數結果評估細胞增殖情況。

2.5 轉染CGRP 對大鼠MSCs 血管形成能力的影響

用4 ℃預冷的無血清基礎培養基按1∶5 的比例稀釋MaxGelTMECM，按50 μL/well 接種于96 孔板，置于37 ℃培養箱孵育過夜。分組轉染細胞，12 h 后以1 ×104cells/well，按實驗分組進行接種，實驗分組和步驟如上，每組3 復孔。誘導培養14 d 后鏡下觀察其生長狀態并拍照。

3 統計學處理

應用SPSS 16.0 軟件包分析。數據用均數±標準差(mean ±SD)表示，組間差異采用單因素方差分析。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 大鼠骨髓MSCs 的分離、培養和轉染

密度梯度離心獲得比較均一的球形單個核細胞，培養2 ～3 d 后首次換液，約7 ～10 d 細胞融合成單層，鋪滿瓶底。消化傳代后生長較快，3 d 可鋪滿瓶。各組細胞經誘導后增殖緩慢，有部分細胞死亡并脫落，而存活的細胞形態漸漸趨于均一，誘導后4 d 可見細胞由原來扁平多角形漸變為扁圓形、圓形或橢圓形，細胞狀態比較穩定。經EGFP 標記的慢病毒轉染MSCs 后，應用熒光顯微鏡觀察可見細胞發出綠色熒光，細胞計數法所得細胞轉染率達80%，說明Lenti-CGRP 成功地被轉入MSCs，見圖1。

Figure 1. Mesenchymal stem cells were cultured and transfected.A:primary cells cultured for 7 d (×40);B:passage cells (×100);C:untransfected cells (×100);D:cells transfected with Lenti-CGRP for 3 d (×100);E:cells transfected with Lenti-CGRP for 14 d，showing a cobblestone-like appearance (×100);F:untransfected cells showing a fiber-like appearance (×100).圖1 細胞培養及轉染圖片

2 ELISA 檢測CGRP 表達

CGRP 轉染MSCs 后1 d，培養基中有少量CGRP表達，CGRP 轉染后3 d，CGRP 蛋白明顯增加，與對照組比較有顯著差異［(19.530 ± 0.498)ng/L vs(3.120 ±0.001)ng/L，P ＜0.05］，說明CGRP 成功轉染MSCs 后，MSCs 能分泌CGRP 蛋白，轉染后3 d達高峰。

3 轉染CGRP 對大鼠MSCs 內皮分化的影響

SP 染色評估細胞胞質出現咖啡色免疫復合物為陽性細胞，隨機選取5 個視野，計數陽性細胞數后計算細胞陽性率，結果顯示，轉染Lenti-CGRP 的MSCs細胞爬片CD31 染色大部分細胞呈陽性表達(89.3%)，而加入CGRP 受體拮抗劑后CD31 的表達率下降(52.3%)，CGRP 組與CGRP +CGRP8-37及對照組比較差異顯著(P ＜0.05);CGRP 組Ⅷ因子相關抗原染色陽性細胞率為65.2%，而加入CGRP 受體拮抗劑后Ⅷ因子相關抗原的表達率下降(35.3%)，CGRP 組與CGRP +CGRP8-37及對照組比較差異顯著(P ＜0.05)，見圖2。

4 轉染CGRP 對MSCs 增殖的影響

轉染CGRP 對誘導后MSCs 的增殖有影響，CGRP 組細胞數量增長很快，而對照組細胞增殖較慢，這種變化在細胞轉染CGRP 3 d 后最明顯(P ＜0.05)，隨著轉染時間的延長，細胞增殖速度無明顯增加。而加入CGRP 受體拮抗劑后上述細胞增殖現象明顯減弱，在轉染后3 d、5 d、7 d 和9 d 的細胞數量與CGRP 組相比有顯著差異(P ＜0.05)，見表1。這說明CGRP 能增強并保持MSCs 向內皮細胞分化后的干細胞增殖特性。

5 轉染CGRP 對MSCs 血管形成能力的影響

細胞轉染后14 d，鏡下觀察到對照組MSCs 在纖維膠表面仍呈單層細胞纖維狀生長，轉染Lenti-CGRP 后MSCs 呈環形及線性生長，可發現血管管腔樣結構，而加入CGRP 受體拮抗劑后MSCs 的這種環形及線性結構減弱，見圖3。

討 論

血管再生治療是當今缺血性疾病研究領域關注的熱點，心肌梗死是臨床常見的一種嚴重的缺血性疾病，盡管目前臨床采用的冠狀動脈介入治療和搭橋手術在很大程度上改善了心肌缺血，但對于急性和慢性冠狀動脈狹窄閉塞引起的嚴重而持久的缺血，尤其是在無法實施手術治療時，其預后仍不理想。近年來，細胞移植治療雖在心肌梗死治療中取得了顯著的效果，但針對梗死后新生血管再生等方面的作用仍有限。如何提高干細胞移植效率，最大化的增加干細胞血管再生治療，有效恢復梗死后血流灌注是心肌梗死治療的關鍵。

Figure 2. Immunocytochemical staining for CD31 and factor Ⅷ-related antigen in rat MSCsing for (×400).圖2 大鼠MSCs CD31 及Ⅷ因子相關抗原的免疫細胞化學染色

表1 各組大鼠MSCs 增殖的比較Table 1. Comparison of the proliferation of rat MSCs in each group (×105.Mean±SD.n=3)

Figure 3. Angiogenesis of rat MSCs in different groups (×100).圖3 各組大鼠MSCs 管腔樣結構形成圖片

CGRP 是人體內含量最豐富的神經肽，在心血管系統生理和病理調節中起了重要的作用。CGRP 注射大鼠缺血膝關節及缺血后肢，觀察到內皮細胞增生明顯，血管形成增加，CGRP 受體拮抗劑作用后上述的作用明顯被抑制［6-7］。Zheng 等［8］的研究顯示，CGRP 通過調節cAMP-PKA 途徑促進內皮型一氧化氮合酶的合成。CGRP 還能促進人表皮靜脈內皮細胞的增殖和遷移［9］，而CGRP 轉染內皮組細胞后，內皮組細胞分泌的CGRP 能抑制血管內皮細胞增殖［10］。本課題前期研究顯示RAMP1 修飾的MSCs移植更能促進心肌梗死后梗死交界區毛細血管形成，有效恢復梗死后血流灌注，改善梗死后的心功能。而RAMP1 是CGRP 的關鍵調節肽，RAMP1 的作用結果與上調CGRP 的效應性有關。那么CGRP究竟對MSCs 的有無作用呢?

本實驗應用攜帶CGRP 的慢病毒轉染MSCs 后，觀察到MSCs 在一定時間內能分泌CGRP，轉染3 d后達高峰。對照組中隨著培養時間的延長，MSCs 自然分化為成纖維細胞，而轉染CGRP 后，細胞培養1周，發現細胞表現出內皮細胞樣特征，細胞呈典型“鋪路卵石樣”生長，且CD31 和Ⅷ因子相關抗原染色呈陽性，說明MSCs 經誘導干預可以定向分化為內皮細胞。增殖實驗也進一步體現了轉染CGRP 可增加MSCs 內皮分化后的數量并保持干細胞的增殖能力;而轉染CGRP 的MSCs 中加入CGRP 受體拮抗劑后，上述作用明顯被抑制。在血管生成實驗中，轉染CGRP 的細胞培養后14 d 呈環形、線狀生長，加入CGRP 受體拮抗劑后環形、線狀結構生長不明顯，而對照組細胞仍呈纖維樣排列。這說明CGRP 作用MSCs 后可能更有利于調節微血管的發生。

［1］ Otto Beitnes J，?ie E，Shahdadfar A，et al. Intramyocardial injections of human mesenchymal stem cells following acute myocardial infarction modulate scar formation and improve left ventricular function［J］. Cell Transplant，2012，21(8):1697-1709.

［2］ Jin J，Zhao Y，Tan X，et al. An improved transplantation strategy for mouse mesenchymal stem cells in an acute myocardial infarction model［J］. PLoS One，2011，6(6):e21005.

［3］ 石 蓓，劉志江，趙然尊，等. 骨髓間充質干細胞移植對心肌梗死后心臟功能及損傷血管再狹窄的影響［J］.中華醫學雜志，2011，91(32):2269-2273.

［4］ 龍仙萍，趙然尊，石 蓓，等. hRAMP1 修飾的骨髓間充質干細胞移植對兔球囊損傷血管再狹窄及心功能的影響［J］. 中華醫學雜志，2012，92(30):2134-2139.

［5］ 龍仙萍，趙然尊，石 蓓，等. 人受體活性修飾蛋白1基因修飾的骨髓間充質干細胞對兔血管成形術后新生內膜的影響［J］. 中國病理生理雜志，2012，28(4):675-682.

［6］ Mapp PI，McWilliams DF，Turley MJ，et al. A role for the sensory neuropeptide calcitonin gene-related peptide in endothelial cell proliferation in vivo［J］. Br J Pharmacol，2012，166(4):1261-1271.

［7］ Mishima T，Ito Y，Hosono K，et al. Calcitonin gene-related peptide facilitates revascularization during hindlimb ischemia in mice［J］. Am J Physiol Heart Circ Physiol，2011，300(2):H431-H439.

［8］ Zheng S，Li W，Xu M，et al. Calcitonin gene-related peptide promotes angiogenesis via AMP-activated protein kinase［J］. Am J Physiol Cell Physiol，2010，299(6):C1485-C1492.

［9］ Tuo Y，Guo X，Zhang X，et al. Effect of calcitonin generelated peptide on proliferation and migration of human umbilical vein endothelial cells［J］. Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi，2012，26(4):495-500.

［10］Fang L，Chen MF，Xiao ZL，et al. Calcitonin gene-related peptide released from endothelial progenitor cells inhibits the proliferation of rat vascular smooth muscle cells induced by angiotensin II［J］. Mol Cell Biochem，2011，355(1-2):99-108.