瑞舒伐他汀抑制C-反應蛋白誘導的晚期內皮祖細胞炎癥因子的表達*

鐘鈞琳， 彭 隆， 羅艷婷， 劉金來

(中山大學附屬第三醫院心內科，廣東 廣州510630)

C-反應蛋白(C-reactive protein，CRP)不僅是一種炎癥標志物和心血管疾病強有力預測因子，而且參與了從脂質條紋形成到易損斑塊破裂所致急性冠脈綜合征的形成過程［1］。CRP 可通過減少一氧化氮(nitric oxide，NO)的釋放［2］、上調黏附分子的表達［3］、刺激平滑肌細胞增殖及遷移［4］、激活補體系統［5］等一系列生物學作用導致內皮動脈粥樣硬化。

血管內皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是內皮細胞前體細胞，參與血管損傷后修復，維持血管壁完整性。EPCs 分為早期內皮祖細胞(early EPCs)和晚期內皮祖細胞(late EPCs;又稱endothelial outgrowth cells，EOCs)。自1997 年Arasaha等［6］從人外周血中分離出內皮祖細胞以來，大多數研究將能攝取乙酰化低密度脂蛋白(ac-LDL)和結合荊豆凝集素(UEA-1)，并表達CD34、VEGFR2 和CD133 等抗原的一群細胞稱為EPCs。2000 年Lin等［7］從人外周血中成功分離培養出EOCs。EOCs 是一類能增殖并分化為成熟且有功能的血管內皮細胞的前體細胞。Hur 等［8］發現EOCs 比早期EPCs 有更強的黏附能力，在體外血管形成能力上，EOCs 要顯著強于早期EPCs。

本課題擬研究CRP 對EOCs 旁分泌致炎因子單核細胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)、白細胞介素8(interleukin-8，IL-8)、血管細胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)及細胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)情況的影響，以及探討他汀藥物瑞舒伐他汀對CRP 所致致炎因子的作用，進一步提供CRP 致炎、致動脈粥樣硬化的證據，為動脈粥樣硬化的防治提供新的靶點。

材 料 和 方 法

1 主要材料與試劑

淋巴細胞分離液購于MP Biomedicals;內皮細胞基礎培養基(endothelial basal medium-2，EBM-2)購于Lonza，內皮細胞培養基生長因子套裝(EGM-2 singleQuot Kit Suppl ＆ Growth Factors)購于Clonetics;人纖維連接蛋白(fibronectin，FN)購于Millipore;重組人C 反應蛋白CRP 購自Calbiochem;DiI-乙酰化低密度脂蛋白(DiI-ac-LDL)購于Molecular Probe;FITC-荊豆凝集素Ⅰ(FITC-UEA-I)購于Sigma;FITC-CD14、FITC-CD34、PE-VEGFR2 和PC5-CD45 均購于BD，PE-CD133 購于Miltenyi;Trizol 試劑購于Invitrogen;逆轉試劑盒購于TaKaRa;熒光定量PCR 試劑盒購于TaKaRa;MCP-1 和VCAM-1 ELISA 試劑盒購于Bender;瑞舒伐他汀購于南京德寶公司。

2 方法

2.1 人臍血EOCs 的分離與培養 收集中山三院健康足月產孕婦臍帶血30 mL，所有血標本的獲得均告知產婦，并簽署知情同意書。用PBS 緩沖液1∶1稀釋，鋪于淋巴細胞分離液表面，稀釋血與淋巴細胞分離液體積比為2 ∶1，形成清晰界面。800 × g 離心30 min，將白膜狀單個核細胞吸入另一管內，PBS 清洗2 次后，用5%胎牛血清EGM-2 培養液重懸，接種于包被有纖維連接蛋白的6 孔板，置37 ℃、5%CO2培養箱(95%空氣)中孵育24 h 后用PBS 輕柔洗去未貼壁細胞并更換新鮮培養液。此后每3 d 更換全部培養液。待原代細胞生長匯合后傳代進行下一步實驗。

2.2 EOCs 的鑒定

2.2.1 DiI-ac-LDL 和FITC-UEA-1 雙熒光染色鑒定

取傳代后第2 代細胞與10 mg/L DiI-ac-LDL 置于37 ℃下孵育4 h，以2%多聚甲醛固定10 min，再加入10 mg/L FITC-UEA-1，37 ℃孵育1 h。熒光顯微鏡下觀察，DiI-ac-LDL 和FITC-UEA-1 雙染色陽性的細胞即為正在分化的EOCs。

2.2.2 流式細胞術測定法 將傳代后第2 代細胞以0.25%胰酶消化后，制成106個細胞/L 單細胞懸液加入熒光標記抗CD34、KDR、CD133、CD14 和CD45 抗體各5 μL，避光孵育30 min 后上機，流式細胞儀分析EOC 的CD34、KDR、CD133、CD14 和CD45表達。

2.3 細胞分組處理 取第3 ～6 代細胞分為3 組進行實驗。CRP 量效組:將CRP 不同濃度(0、5、10、25、50 mg/L)分別與EOCs 孵育。CRP 時效組:將50 mg/L CRP 分別與EOC 孵育不同時間(0、3、6、12 h)。瑞舒伐他汀量效組:將細胞用瑞舒伐他汀不同濃度(10-8mol/L，10-7mol/L，10-6mol/L)預孵育12 h，再加入CRP 50 mg/L 刺激。空白對照不加任何試劑，陽性對照只加CRP 50 mg/L。

2.4 熒光定量PCR 檢測 分別收集各組細胞，按照Trizol 說明書提取各組細胞總RNA 后，將RNA 逆轉錄為cDNA，cDNA 逆轉錄按試劑盒說明書進行。以所逆轉錄的cDNA 為模板，各靶基因PCR 引物設計參考文獻，由上海英濰捷基公司合成。IL-8 正義序列5'-AAACCACCGGAAGGAACCAT-3'，反義序列5'-CCTTCACACAGAGCTGCAGAAA-3';MCP-1 正義序列5'-CAGCCAGATGCAATCAATGC-3'，反義序列5'-GTGGTCCATGGAATCCTGAA-3';VCAM-1 正義序列5'-CAAATCCTTGATACTGCTCATC-3'，反義序列5'-TTGACTTCTTGCTCACAGC-3';ICAM-1 正義序列5'-CTCAGTCAGTGTGACCGCAGA-3'，反 義 序 列 5'-CCCTTCTGAGACCTCTGGCTTC-3';內參照β-actin 正義序列5'-CAACTGGGACGACATGGAGAAA-3'，反義序 列 5'-GATAGCAACGTACATGGCTGGG-3'。使 用SYBR? Green 嵌合熒光法，按試劑盒進行操作。95℃30 s 預變性后，95 ℃5 s，60 ℃34 s，40 個循環，最后95 ℃15 s，60 ℃1 min，95 ℃15 s 融解。根據2-ΔΔCt值計算mRNA 表達的相對量。

2.5 ELISA 檢測 細胞經分組處理培養后收集上清液，步驟嚴格按照試劑盒操作說明進行，分別檢測細胞上清液中MCP-1 和ICAM-1 表達量。

3 統計學處理

每組實驗重復3 次以上，計量資料以均數±標準差(mean ±SD)表示。主要統計數據均進行正態性及方差齊性檢驗，正態分布數據組間差異性比較采用單因素方差分析，LSD 法進行兩組間多重比較。采用SPSS 15.0 統計軟件進行分析，以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 EOCs 的鑒定

臍血分離獲得的單個核細胞培養約第4 ～6 d 開始出現梭形細胞，第6 ～8 d 左右形成若干個細胞集落，在15 ～20 d 左右各個集落相互融合呈橢圓形鋪路石樣排列(圖1A)。熒光顯微鏡觀察，DiI-ac-LDL和FITC-UEA-1 雙染色陽性的細胞為正在分化的EOCs(圖1D)。用流式鑒定法可見干細胞標志CD34陽性率30.6%，CD133 陽性率5.97%，內皮細胞系標志KDR(VEGFR2)陽性率92.9%，而CD14 陽性率3.26%，CD45 陽性率2.96%，見圖2。

Figure 1. Morphoplogy and identification of the EOCs(×200). A:cobblestone-like cells;B:DiI-ac-LDL;C:FITC-UEA-1;D:merged.圖1 EPCs 細胞形態及熒光染色鑒定結果

Figure 2. Phenotyping of EOCs detected by flow cytometry.圖2 EOCs 流式鑒定結果

2 CRP 刺激EOCs 后炎癥 因子IL-8、MCP-1、VCAM-1 和ICAM-1 mRNA 表達

CRP(5、10、25 和50 mg/L)刺激EOCs 6 h 后，IL-8 mRNA 表達量分別為97%、98%、141% 和198%，MCP-1 mRNA 表達量分別為99%、116%、152% 和197%，VCAM-1 mRNA 表達量分別為102%、119%、133%和147%，ICAM-1 mRNA 表達量分別為102%、103%、130%和160%，在CRP 50 mg/L 刺激下四者的表達量均達高峰，與對照組比較差異有統計學意義(P ＜0.01)，見圖3A。同時，我們用CRP 50 mg/L 分別刺激EOCs 3、6 和12 h，IL-8 mRNA 的表達量分別為227%、260% 和120%，MCP-1 mRNA 表達量分別為340%、180%和109%，VCAM-1 mRNA 表達量為152%、260%和102%，ICAM-1 mRNA 表達量為155%、173% 和127%，可見IL-8、VCAM-1 和ICAM-1 mRNA 表達量在CRP 刺激6 h達高峰，MCP-1 mRNA 表達量在CRP 刺激3 h 后達高峰，且與對照組比較均差異有統計學意義(P ＜0.01)，見圖3B。

3 CRP 刺激EOCs 后MCP-1 和VCAM-1 蛋白表達

在CRP 為5、10、25 和50 mg/L 濃度下培養12 h，上清液中MCP-1 蛋白表達量分別為218.9 ng/L、240.2 ng/L、343.0 ng/L 和512.0 ng/L(對 照 組212.5 ng/L)，VCAM-1 蛋白表達量分別為34.8 ng/L、37.7 ng/L、48.5 ng/L 和61.2 ng/L(對照組34.5 ng/L)，其中50 mg/L 組與對照組比較差異有統計學意義(P ＜0.05)，見表1。同樣，EOCs 在CRP 50 mg/L 濃度刺激3、6 和12 h，上清液中MCP-1 蛋白表達量為346.8 ng/L、460.2 ng/L 和517.5 ng/L(對照組276.7 ng/L)，VCAM-1 蛋白表達量為31.8 ng/L、32.1 ng/L和45.8 ng/L(對照組30.5 ng/L)，其中CRP 刺激12 h 組與對照組比較兩者均有顯著差異(P ＜0.05)，見表2。

Figure 3. Effects of CRP on the expression of IL-8，MCP-1，VCAM-1 and ICAM-1 mRNA in EOCs. A:EOCs were treated with CRP at different concentrations (0，5，10，25 and 50 mg/L)for 6 h;B:EOCs were incubated with 50 mg/L CRP for different exposure time(0，3，6 and 12 h). Mean ± SD. n = 3. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control.圖3 CRP 對EOCs IL-8、MCP-1、VCAM-1 和ICAM-1 mRNA 表達的影響

表1 不同濃度CRP 刺激EOCs 后細胞上清液MCP-1 和VCAM-1 的變化Table 1. Supernatant MCP-1 and VCAM-1 levels in EOCs stimulated with CRP at different doses(ng/L.Mean±SD.n=3)

表2 50 mg/L CRP 不同時間刺激EOCs 后細胞上清液MCP-1 和VCAM-1 的變化Table 2. Supernatant MCP-1 and VCAM-1 levels in EOCs stimulated with 50 mg/L CRP at different time points(ng/L.Mean±SD.n=3)

4 瑞舒伐他汀下調CRP 所致的EOCs IL-8、MCP-1 、VCAM-1 和ICAM-1 mRNA 表達

以50 mg/L CRP 刺激6 h 為陽性對照，分別用不同濃度的瑞舒伐他汀(10-8、10-7和10-6mol/L)預孵育12 h 再加50 mg/L CRP 刺激6 h。與空白對照組比較，陽性對照組細胞內IL-8、MCP-1、VCAM-1 和ICAM-1 mRNA 表達量分別為205%、161%、268%和194%。隨著瑞舒伐他汀濃度增加(10-8、10-7和10-6mol/L)，各基因表達量均減少，IL-8 mRNA 表達量分別為165%、131%和66%;MCP-1 mRNA 表達量分別為155%、138%和94%;VCAM-1 mRNA 表達量分別為265%、208%和144%;ICAM-1 mRNA 表達量分別為190%、180%和126%。各基因在10-6mol/L組與陽性對照CRP 組比較表達量均下降，差異均有統計學意義(P ＜0.05)，見圖4。

5 瑞舒伐他汀下調CRP 刺激EOCs 所致的MCP-1和VCAM-1 蛋白表達

以50 mg/L CRP 刺激12 h 為陽性對照，分別用瑞舒伐他汀不同濃度(10-8、10-7和10-6mol/L)預孵育12 h 再加50 mg/L CRP 刺激12 h。陽性對照組細胞上清液中MCP-1 和VCAM-1 蛋白表達量分別為606 ng/L(對照組276.7 ng/L)和51.0 ng/L(對照組32.0 ng/L)。隨著他汀濃度增加，上清液中MCP-1蛋白表達量分別為559.6 ng/L、494.8 ng/L 和217.5 ng/L;VCAM-1 上清液蛋白表達量分別為46.8 ng/L，38.1 ng/L 和26.2 ng/L。各基因10-6mol/L 組與陽性對照CRP 組比較表達量均下降，均有統計學意義(P ＜0.05)，見表3。

Figure 4. Effects of rosuvastatin on CRP-induced expression of IL-8，MCP-1，VCAM-1 and ICAM-1 in EOCs. EOCs were treated with different concentrations of rosuvastatin (10 -8，10 -7 和10 -6 mol/L)for 12 h，and then stimulated with 50 mg/L CRP.Maen±SD. n =3. * P＜0.05，＊＊ P ＜0.01 vs CRP group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs control.圖4 瑞舒伐他汀對CRP 誘導EOCs IL-8、MCP-1、VCAM-1和ICAM-1 mRNA 表達的影響

表3 瑞舒伐他汀對50 mg/L CRP 刺激后EOCs 細胞上清液MCP-1 和VCAM-1 變化的影響Table 3. Effects of rosuvastatin on supernatant MCP-1 and VCAM-1 levels in EOCs stimulated with 50 mg/L CRP(ng/L.Mean±SD.n=3)

討 論

CRP 是一種非特異性急性期反應蛋白，是體內炎癥反應和組織損傷敏感性指標之一，與冠心病的發生和發展有著密切的關系。冠心病的始動因素是內皮損傷。Liang 等［9］發現，CRP 可通過臍靜脈內皮細胞和大動脈內皮細胞細胞膜上CD32 受體引起轉錄因子NF-κB 激活，使細胞VCAM-1 mRNA 及蛋白表達增高;又有報道CRP 可通過促進晚期糖基化終產物(advanced glycation end-products，AGEs)與內皮細胞表面的晚期糖基化終產物受體(receptor for AGEs，RAGE)結合，促進MCP-1 表達增加，引起單核細胞、中性粒細胞募集、趨化至血管內皮細胞處［10］。而RAGE 與配體相互作用還可激活NF-κB 途徑，導致細胞信號級聯反應，如激活細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)、p38 有絲分裂原激活蛋白激酶(p38 MAPK)和PKC 從而傳遞炎癥信號，上調一系列炎癥細胞因子的表達［11］。而IL-8 和MCP-1 可引起單核細胞和中性粒細胞募集、趨化至血管內皮細胞處［12］，同時VCAM-1 和ICAM-1可增加單核細胞和內皮細胞黏附。而單核細胞進入內皮下后，可分化成血管內膜巨噬細胞，脂質攝取轉化為泡沫細胞，泡沫細胞堆積在血管壁上，導致脂肪條紋加速形成，啟動動脈粥樣硬化過程［9］。EPCs 是內皮細胞的前體，它在血管新生和維持內皮功能完整中具有重要作用，有文獻報道［13-14］，CRP 可直接影響EPCs 的增殖、遷移、黏附功能，促進其凋亡，損害其再內皮化功能，降低血管再生潛能。研究發現冠心病患者外周血EPCs 的數量、生物學功能均有顯著下降［15］。故本課題主要研究CRP 對EOCs 是否存在致炎作用，通過體外培養EOCs，發現不同濃度和不同時間的CRP 刺激可促進EOCs 分泌炎癥因子IL-8、MCP-1、VCAM-1 和ICAM-1，這一發現為解釋炎癥和心血管疾病之間的關系提供了依據，然而具體的機制尚未清楚。有文獻報道［16］，MCP-1 能通過p35依賴的線粒體途徑促進內皮細胞凋亡。

他汀類藥物是一類HMG-CoA 還原酶抑制劑，不僅具有降脂作用，還有明顯改善血管內皮功能、抑制炎癥的作用。Chen 等［17］報道，高脂飲食能導致小鼠炎癥相關的內皮功能障礙，而阿托伐他汀能下調體內CRP 和IL-6 水平改善炎癥，并下調內皮素1(endothelin-1，ET-1)及上調NO 水平而改善內皮功能。楊冰等［18］發現阿托伐他汀可通過提高循環中EPCs數量，改善EPCs 的增殖、遷移、黏附功能，增加EPCs對血管內皮細胞的修復能力。那么他汀對于CRP 所致EOCs 炎癥因子情況是否存在影響?本研究首次發現，瑞舒伐他汀能明顯降低CRP 所致EOCs 分泌炎癥因子的水平，這進一步支持了Chang 等［19］的研究:辛伐他汀能抑制CRP 所致的臍靜脈內皮細胞VCAM-1、MCP-1 和IL-8 分泌，抑制CRP 在血管炎癥發生過程中的作用。但瑞舒伐他汀調節CRP 刺激EOCs 所致炎癥的分子機制有待于進一步的研究。

總之，本研究表明CRP 可作為致炎因子刺激晚期內皮祖細胞分泌趨化因子(IL-8、MCP-1)及黏附分子(VCAM-1、ICAM-1);瑞舒伐他汀能顯著抑制CRP刺激EOCs 所致的炎癥因子(IL-8、MCP-1)和黏附分子(VCAM-1、ICAM-1)的分泌，從而為動脈粥樣硬化的防治提供了新的靶點。

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