殺菌/通透性增加蛋白基因Glu216Lys 多態性與中國漢族人群炎癥性腸病無關

楊慶帆， 陳白莉， 張青森， 何 瑤， 陳旻湖， 曾志榮

(中山大學附屬第一醫院消化內科，廣東 廣州510080)

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)是胃腸道的慢性非特異性炎癥性疾病，主要包括潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)和克羅恩病(Crohn disease，CD)［1-2］。近年來，炎癥性腸病在亞洲的發病率顯著升高，但其發病機制尚未明確，目前認為IBD 是一種復雜的多基因疾病，遺傳易感性在其發病中起著重要作用;然而，在目前研究發現的眾多與IBD 發病、臨床特征、藥物療效相關的基因單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)中，大部分SNP 與歐美IBD 相關，而與我國IBD 不相關，因此需要進一步研究影響我國IBD 人群的基因位點。

宿主對菌群抗原刺激產生的異常免疫反應被認為是IBD 重要的發病機制［3-4］。殺菌/通透性增加蛋白(bactericidal/permeability-increasing protein，BPI)是參與到宿主識別菌群抗原過程的重要因子，它能夠競爭性結合革蘭陰性(G-)菌的主要抗原脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，從而非特異性殺傷G-菌［5］，中和LPS;同時，BPI 能夠抑制LPS 與Toll 樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)等結合形成復合物，進而減弱該復合物激活的一系列免疫炎癥反應［6-8］，見圖1。因此，BPI 很可能參與到IBD 發病中。國外多項研究顯示BPI 為IBD 易感基因，其單核苷酸多態性Glu216Lys (即rs4358188 或c. 645 G ＞A)與新西蘭、德國、土耳其等人群的IBD 發病和臨床特征相關［9-11］，該位點G 替換為A 能導致谷氨酸變為賴氨酸，可能導致BPI 結合LPS 結構發生變化，從而可能影響BPI 清除細菌、抑制炎癥的功能;此外，國內研究者運用基因芯片技術從全基因組大規模篩選IBD易感基因后，發現BPI 基因在UC 患者外周血單核細胞中較正常人表達上調［12］。因此，BPI 很可能是中國人群的IBD 易感基因，而關于BPI Glu216Lys 與我國人群IBD 的關系尚未見報道，本研究將探討Glu216Lys 與我國人群IBD 易感性的關系及其對不同臨床特征的影響。

Figure 1. Bacterial antigen recognition pathway. CARD15/NOD2 could respond to the bacteria component muramyl dipeptide(MDP)［5］. LBP could bind to extracellular antigen LPS，then LBP-LPS complex is presented to the recognition receptor TLR4 expressed in membranes of epithelial cells and monocytes by CD14. Finally，CARD15/NOD2-MDP or LPS-TLR4 complex will activate the intracellular signaling pathways which lead to activation of the transcription factor，nuclear factorκB (NF-κB)，and then induce the expression of a variety of host defense genes and stimulate the innate immune response［6-8］. However，the BPI protein can effectively compete with LBP for binding to LPS and the BPI-LPS complex does not provoke subsequent immune response.圖1 細菌抗原識別通路

材 料 和 方 法

1 研究對象

研究對象為我院2003 年～2011 年IBD 門診及住院確診的286 例IBD 患者(包括CD 173 例，UC 113 例)，以及同期332 名在我院接受健康體檢的性別、年齡匹配的健康人。IBD 的診斷標準參考2007年中華醫學會消化病學分會推薦標準［13］，即根據臨床表現、小腸鋇劑造影檢查、結腸鏡檢查、雙氣囊小腸鏡/膠囊內鏡和黏膜活檢作出臨床診斷，確診病例為經病情觀察符合CD/UC 病程經過或通過手術取得病理診斷者。IBD 的臨床分型采用蒙特利爾分型標準［14］。臨床資料通過查閱我科IBD 數據庫獲得，主要收集患者的人口學資料及臨床分型特征，包括性別、發病年齡、癥狀、吸煙史、家族史、腸外表現、肛周病變、臨床特征等資料。本研究已經中山大學附屬第一醫院臨床研究倫理委員會批準，標本采集獲得研究對象的知情同意。

2 方法

2.1 基因組DNA 提取 分別采集病例及健康對照2 mL 外周血，采用天根血液基因組織DNA 提取試劑盒(北京天根有限公司提供)提取基因組DNA。具體操作步驟參見試劑盒說明書。

2.2 BPI Glu216Lys 基因分型 采用引物介導的限制性分析PCR(primer-introduced restriction analysis PCR，PIRA-PCR)方法。上游引物5’-CACTATGGGAAGACCTTACTGATTAC-3’，下 游 引 物 5’-CAGAGTCTGGAAATAAGGTTGAAGC-3’，在下游引物中引入1 個A 堿基(下劃線處)，用于構建內切酶Hind III 的限制性切點。PCR 反應條件:95 ℃預變性3 min;95 ℃30 s，51 ℃30 s，72 ℃30 s，35 個循環;72 ℃10 min，冷卻至4 ℃保存。PCR 產物以限制性內切酶Hind III (New England Biolabs)于37 ℃酶切2 h，再于65 ℃20 min 使酶失活。用含溴化乙啶的4%瓊脂糖凝膠電泳。

基因型判定:PCR 產物為104 bp，在Hind III 內切酶作用下，A 等位基因可被切成78 和26 bp 2 個片段(26 bp 的片段過小，難以檢測);G 等位基因則不能被切開，電泳顯示104 bp 的條帶，見圖2。抽樣測序結果與電泳結果一致。

Figure 2. Glu216Lys mutation analysis with restriction enzyme Hind III.M:marker.圖2 Glu216Lys 位點Hind III 酶切電泳圖

3 統計學處理

應用SPSS 13.0 統計軟件行統計學分析。根據Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律，采用χ2檢驗分析對照組樣本的群體代表性。病例組與對照組間Glu216Lys 基因型分布頻率的比較采用Pearson-χ2檢驗;基因型與IBD 臨床特征間關系采用單因素和Logistic 回歸分析，計算優勢比(odds ratio，OR)及其95%置信區間(confidence interval，CI)，其中OR 值經性別和年齡校正。數據以均數±標準差(mean ±SD)表示。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 一般情況

病例組納入的286 名IBD 病人中，男178(62.2%)例，女108(37.8%)例，平均年齡(33.5 ±13.1)歲，見表1;正常對照中，男197 例(59.3%)，女135 例(40.7%)，平均年齡(32.0 ±8.2)歲;2 組間性別構成比和年齡均無明顯差異(均P ＞0.05)。對照組Glu216Lys 基因型分布頻率符合Hardy-Weinberg平衡(P ＞0.05)，具有群體代表性。

表1 炎癥性腸病病人基本資料Table 1. Demographic characteristics of IBD patients

2 BPI Glu216Lys 基因型在炎癥性腸病及對照人群中頻率分布

CD 和UC 病人中，分別檢測出GG 基因型95(54.9%)和 69 (61.1%)例，GA 基 因 型 68(39.4%)和38(33.6%)例，AA 基因型10 (5.7%)和6 (5.3%)例;對照人群中，GG 基因型206(62.1%)例，GA 基因型115(34.6%)例，AA 基因型11(3.3%)例;無論是CD 還是UC 病人，Glu216Lys基因型頻率及等位基因頻率均與對照組無明顯差異(P ＞0.05)，見表2。

表2 Glu216Lys 基因型在正常對照及病例中分布情況Table 2. Allelic and genotypic frequencies of the Glu216Lys polymorphism in IBD patients and controls

3 BPI Glu216Lys 基因型與IBD 臨床特征的關系

根據不同臨床特征對CD 和UC 患者進行分層，分析Glu216Lys 基因型與疾病各類臨床特征的相關性。單因素分析方法結果顯示該基因型與UC/CD各臨床特征不相關(P ＞0.05)，為排除混雜因素影響，進一步采用多因素分析方法，經年齡、性別等因素校正后，結果仍顯示該基因型與CD 或UC 的臨床特征無關(P ＞0.05)，見表3、4。

表3 Glu216Lys 基因型與CD 臨床特征的相關性Table 3. Association between Glu216Lys genotypes and CD clinical characteristics

表4 Glu216Lys 基因型與UC 臨床特征相關性Table 4. Association between Glu216Lys genotypes and UC clinical characteristics

討 論

BPI 是先天免疫系統中抵御革蘭陰性桿菌的重要因子，它對LPS 具有高親和力，能與G-菌表面LPS 及游離LPS 結合，進而促進菌體裂解、中和內毒素以及促進補體活化、增強調理吞噬等。BPI 在多形核細胞中表達豐富，也廣泛地表達于腸道等人體黏膜上皮細胞中［15］。國外研究報道了BPI 在IBD 患者黏膜中表達升高［16］，我國研究［13］發現BPI mRNA在UC 患者中的相對表達量明顯高于正常對照組(P＜0.05)，國內外研究也發現BPI 是IBD 患者體內抗中性粒細胞胞漿抗體(antineutrophil cytoplasmic antibodies，ANCA)的主要靶抗原之一［17］，并且BPI 自身抗體在IBD 中呈高表達，它能增強IBD 病人局部和全身炎癥，延長炎癥持續時間［18］;故這些預示BPI 可能在IBD 中起著重要作用。BPI Glu216Lys 可以導致一個氨基酸改變，這可能最終影響BPI 蛋白抵御革蘭陰性菌的功能，此外，該位點多態性可能改變被核周型ANCA 識別的BPI 蛋白結構，從而參與IBD 疾病過程;BPI 單核苷酸多態性位點Glu216Lys 已被證實與多國人群IBD 易感性有關［9-11］，因此，本文研究了BPI Glu216Lys 是否與中國人IBD 發病及臨床特征相關。

我們的研究結果顯示BPI Glu216Lys 與中國人群CD 或UC 的發病無明顯相關性，進一步分析亦未發現其與疾病臨床特征相關。BPI Glu216Lys 的GG基因型頻率在德國CD 患者中相對于正常對照人群明顯下降(P ＜0.05)［10］，而在新西蘭人群中，該SNP的A 等位基因與回結腸型CD 相關(P ＜0.01，OR=1.16，95%CI:1.14 ～2.27)［9］;此外來自土耳其的研究［11］表明它與UC 和CD 發病均相關(P ＜0.01)，并且GG 基因型在激素依賴患者中表達明顯下降(P ＜0.05，OR =0.75，95%CI:0.66 ～0.86)。與這些國家人群相比，我們發現中國人群中野生型純合子GG基因型頻率顯著增高，而突變型純合子AA 頻率顯著下降(P ＜0.05)，見圖3，這進一步證實不同人群存在顯著的遺傳差異，因此我們的研究結果與這些種族人群的不同，一方面可能是我們的樣本量較小，未能發現兩者的聯系;另一方面，BPI 很可能與其它參與細菌識別過程的IBD 易感基因如NOD2/CARD15等相似［8］，是白種人的IBD 易感基因，而非中國人群的IBD 易感基因。

Figure 3. Frequency analysis of Glu216Lys genotypes in general population among different races. 1:Chinese population;2:Turkey population;3:Germany population;4:New Zealand population. ＊＊P ＜0.01 vs group 1.圖3 不同種族的正常人群中Glu216Lys 基因型分布頻率

綜上所述，本研究表明BPI Glu216Lys 位點與我國漢族人群IBD 易感性無明顯相關性，但不能排除該位點與其它基因位點的相互作用或BPI 基因的其它SNP 位點與我國漢族人群IBD 相關。BPI 基因與中國人群IBD 易感性關系仍需要進一步大樣本多位點研究，并進行關聯分析和單倍體型分析等，以進一步明確該基因多態性在IBD 中的作用。

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