南極磷蝦中蝦青素超臨界CO2 萃取方法研究

翁 婷，金銀哲，陶寧萍 ，王錫昌

上海海洋大學食品學院，上海201306

磷蝦是一類多年生的海洋浮游甲殼動物，屬節肢動物門、甲殼綱、磷蝦目，體形似小蝦，長4～5 cm，最大的可達7 cm。目前共發現的磷蝦共有85種，生活在南極水域的11 種磷蝦統稱為南極磷蝦，其中數量最多、個體最大的是南極大磷蝦，也就是我們平常所稱的南極磷蝦(Euphausia superba)［1］。據最新預測數據，南極約有6.5～10 億噸的磷蝦資源，幾乎整個南極海域都有分布。開發和利用南極磷蝦資源不僅具有重要的經濟價值，而且具有重要的社會意義。俄羅斯和日本等國將南極磷蝦加工成傳統的海產品，已經上市很多年。歐美等西方國家也相繼成功開發南極磷蝦油，該制品被認為可預防心腦血管疾病、炎癥、惡性腫瘤、癡呆癥、糖尿病、視力減退等多種疾病。這些功能被推測是由多種不飽和脂肪酸和其它脂溶性物質(類胡蘿卜素、維生素、甾醇等)相互疊加效應造成的。類胡蘿卜素主要存在于南極磷蝦的甲殼中，含量約為3～4 mg/100 g 冰鮮樣，其中含有豐富的蝦青素［2］。因此，南極磷蝦是提取蝦青素的良好原料。

類胡蘿卜素(Carotenoids)，分子式一般為C40H56，是一類呈黃色、橙紅色或紅色的多烯類物質。它是國際公認的具有生理活性的功能性色素，是人體及動物維生素A 的重要來源;同時也是一類非常有效的抗氧化劑，具有很高的經濟價值。蝦青素(Astaxanthin)是類胡蘿卜素的含氧衍生物，屬于酮式類胡蘿卜素，全稱為3，3'-二羥基-4，4'-二酮基-β，β'-胡蘿卜素。蝦青素中4 個異戊二烯以共軛雙鍵結構存在，其自由基淬滅活力是β-胡蘿卜素的10倍、維生素E 的100 倍，同時具有抵御紫外線、抗腫瘤、提高免疫力、增強神經連通和改善生育等作用，在食品添加劑、水產養殖、化妝品及保健品等方面具有廣闊的應用前景。

類胡蘿卜素的提取方法有很多種，一般采用溶劑法來提取甲殼類動物的類胡蘿卜素［3］。選用提取劑在考慮提取效果的同時，也要考慮溶劑的毒性。氯仿等試劑，提取效果明顯，但毒性較大，易揮發，并存在致癌風險。工業上，常用正己烷等溶劑提取類胡蘿卜素，這些溶劑提取效果差，成本高，提取過程中易造成活性成分的氧化降解。超臨界CO2萃取技術(Supercritical CO2extraction，SC-CO2extraction)是近年來發展的一種新型的分離技術，因具有低溫、操作簡單、效率高、無污染、選擇性強等特點，被稱為天然產物研究與開發中的一種具有相當發展潛力的高新提取分離方法，可適用于蝦青素的提取。

分光光度法(Spectrophotometry)和高效液相色譜法(High performance liquid chromatography，HPLC)是常用的兩種類胡蘿卜素分析方法，這兩種方法各有特點，分別適用于不同的分析測定要求。HPLC 法測定因其分析精確度高，重復性高等優點可用于蝦青素的定量測定。分光光度法雖然不能分離測定單種類胡蘿卜素的量，但作為總類胡蘿卜素測量的常用方法，具有快速、簡單、易操作、經濟實用的特點。

目前，超臨界CO2流體萃取蝦青素的研究集中于藻類和甲殼類廢棄物，主要影響因素有:樣品原料特性、萃取壓力、溫度、時間、CO2用量和流速、夾帶劑的選擇和用量。國內外以超臨界CO2流體萃取南極磷蝦中蝦青素的研究報道較少。Abdelkader［4］等以超臨界CO2萃取南極磷蝦蝦青素，比較超臨界CO2法和有機溶劑法，實驗結果顯示，超臨界CO2法萃取效果明顯優于有機溶劑法。該研究僅討論了萃取溫度，壓力對蝦青素萃取率的影響。Reverchon E［5］等人的研究結果顯示，超臨界CO2流體為非極性溶劑，在提取過程中，添加適量的極性夾帶劑，可以有效地提高蝦青素的溶解力和選擇性。一般常用的夾帶劑有乙醇，二氯甲烷等，從食品安全的角度考慮，乙醇因其無毒的特點而成為人們使用最多的夾帶劑。本研究選用凍干的南極磷蝦作為研究對象，采用超臨界CO2萃取法萃取南極磷蝦中的蝦青素，并結合高效液相色譜法，分析討論夾帶劑(無水乙醇)用量，萃取壓力和溫度對萃取率的影響，從而確定最佳工藝參數，為工業大規模提取南極磷蝦蝦青素提供基礎理論依據，促進加工企業的發展和漁業資源的可持續利用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

南極磷蝦由我國“南極海洋生物資源開發利用項目組”于南極FAO 48.1 區捕撈，船上凍結后-20℃左右凍藏，冷凍方式運至實驗室。每塊完整的南極磷蝦約20 kg(規格為23 ×14 ×6 cm)經塑料密封包裝，并貯藏于-30 ℃冰柜直至使用。經測定，該批次南極磷蝦中水分含量為78.26 ±0.03%，粗脂肪含量為3.87 ±0.05%，灰分含量為3.08 ±0.03%，粗蛋白含量為13.68 ±0.04%。對其進行冷凍干燥后，經測定水分含量為2.19～3.81 g/100 g，迅速碾磨粉碎，顆粒大小約為0.180～0.250 mm，分別裝入自封袋中，避光、密封于-80 ℃以下待用。

CO2、N2純度大于99.99%，購自上海利旦氣體有限公司;蝦青素標準品，CA10307000，純度為＞95. 5%，購自Dr. Ehrenstorfer GmbH，德國;甲醇(MeOH)、二氯甲烷(DCM)、乙腈(ACN)、水為色譜純，其余試劑為分析純，GF254硅膠薄層板，購自國藥試劑有限公司。

1.2 主要儀器、設備

Spe-ed SFE-2 超臨界萃取儀，美國Applied Separations 公司;Waters e2695 高效液相色譜儀，配有2998 紫外檢測器，美國Waters 公司;XbridgeTMC18色譜柱(4. 6 × 250 mm，5 μm)，美國Waters 公司;Avanti J-26 XP 真空冷凍離心機，美國Beckman Coulter 公司;UV-2000 型紫外可見分光光度計，尤尼柯(上海)儀器有限公司;A11 組織勻漿機，德國IKA公司;BT224S 分析天平;層析缸，10 ×20 cm，上海生工生物工程公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 類胡蘿卜素的提取和測定

總類胡蘿卜素的提取和測定參照Chalida Niamnuy 等的方法［6］，在其基礎上進行改進。稱取3.5 g左右凍干的南極磷蝦樣品，置于50 mL 離心管，加入20 mL 丙酮，均質2 min，4 ℃、5000 g 離心10 min，收集上清液，重復4 次萃取，直至上清液基本無色，合并丙酮萃取液于分液漏斗中。向分液漏斗中加入等量的石油醚(80 mL)，充分搖動，再加入100 mL 的氯化鈉溶液(0.1%，w/v)，靜置分層，棄去下相，無水Na2SO4干燥、過濾，濾液40 ℃以下減壓濃縮至干，即得南極磷蝦類胡蘿卜素提取物。將提取物溶解于25 mL 的正己烷中，以相應的有機溶劑作對照，置于1 cm 加蓋石英吸收池內，掃描樣品的吸收光譜，掃描范圍為350～600 nm，蝦青素標樣作對照品，分光光度計法測定提取物中類胡蘿卜素的含量。

1.3.2 類胡蘿卜素的分離

類胡蘿卜素的鑒定方法參照文獻中的方法［7］。薄層層析展開劑體積比為丙酮:正己烷=1∶3，層析板為硅膠G 薄層板，使用前110 ℃下活化30 min。取一定量樣品、蝦青素標準品多次點樣于硅膠板上，待點樣點風干后，放入已盛有展開劑的層析缸進行展開，待展開劑到達距硅膠板上層邊緣2 cm 左右時取出。

1.3.3 超臨界CO2流體萃取南極磷蝦蝦青素

稱取12 g 左右樣品均勻填置于50 mL 萃取釜內，加入夾帶劑無水乙醇，設定萃取溫度、分離溫度，檢查設備的氣密性。打開CO2、N2貯氣罐閥門，從鋼瓶中流出的CO2經凈化進入冷凝箱液化冷凝至流體，與N2一起經高壓計量泵加壓至所需的萃取壓力，然后經加熱器加熱至設定溫度，由底部進入萃取釜內進行萃取，靜態萃取30 min 后，打開分離閥動態萃取3 h，收集萃取物待用。考察以下3 個因素對蝦青素的提取效果:夾帶劑用量(0.30、0.50、0.67、0.83、1.00 mL/g 干樣)、萃取溫度(45、50、55、60、65℃)、萃取壓力(20、25、30、35、40 MPa)。

1.3.4 HPLC 測定蝦青素含量

色譜柱為XbridgeTMC18柱(4. 6 × 250 mm，5 μm);流動相為MeOH-DCM-ACN-H2O(85∶5∶5∶5，v/v);流速為1.0 mL/min;柱溫為30 ℃;進樣量為20 μL;紫外檢測器;檢測波長480 nm;采用色譜峰保留時間定性，外標法峰高定量。準確稱取蝦青素對照品10 mg，用混合溶劑(MeOH-DCM，2∶1，v/v)溶解定容至25 mL 棕色容量瓶中作為蝦青素的對照品儲備液，實驗所用低濃度的對照品溶液由混合溶劑稀釋而得，溶液保存于4 ℃冰箱。將減壓濃縮的類胡蘿卜素提取物和不同條件下的超臨界萃取物，用混合溶劑定容至一定體積，混勻得樣品溶液，微孔濾膜(0.45 μm)過濾后測定蝦青素的含量，計算蝦青素得率(%)=超臨界萃取物中蝦青素含量/原料中蝦青素含量×100%。

1.4 數據處理

分析測定均做三次平行，數據統計分析用SPSS 13.0 處理，描述性統計值使用平均值± 標準差(mean±SD)表示。

2 結果與討論

2.1 類胡蘿卜素的吸收光譜

以正己烷為溶劑，配置一定濃度的蝦青素溶液，用分光光度計對其進行波長掃描(350～600 nm)，實驗結果如圖1 所示，蝦青素溶液和南極磷蝦類胡蘿卜素樣品的吸收光譜基本相同，在470～475 nm的范圍內，蝦青素和南極磷蝦類胡蘿卜素樣品的吸光值之間的差別不大，這與相關研究中報道的蝦青素是南極磷蝦主要類胡蘿卜素的結果相符合［2］。因此可選擇該范圍內的472 nm 作為測量波長。

圖1 類胡蘿卜素提取物和蝦青素標準品的紫外吸收光譜Fig.1UV absorption spectra of carotenoids extract and astaxanthin standard

2.2 標準曲線的繪制

精密稱取1.0 mg 蝦青素標準品，用二氯甲烷溶解后移入25 mL 棕色容量瓶中，稀釋至刻度，混勻，配成40 μg/mL 的蝦青素標準溶液。分別取配制好的蝦青素標準溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL于25 mL 容量瓶中，加正己烷定容至刻度混勻，相當于0.16、0.32、0.48、0.64、0.80、0.96 μg/mL 作為標準系列對照液。以正己烷為空白調零，可見分光光度計測定472 nm 處的吸光值為縱坐標，蝦青素濃度為橫坐標，繪制標準曲線，回歸線性方程可表示為Y=0.63X-0.0178，相關線性系數為R2=0.9991，結果表明蝦青素在0.16～0.96 μg/mL 范圍內，吸光度與蝦青素濃度呈良好的線性關系。經檢測，南極磷蝦中含類胡蘿卜素的含量為4.80 ±0.08 mg/100 g 干樣。

2.3 薄層層析分離類胡蘿卜素

本實驗中，從右至左依次將蝦青素標樣、南極磷蝦類胡蘿卜素的提取物(平行樣1、2、3)展開于薄層上，所得圖譜如圖2，測量各Rf值。由圖2 可知，類胡蘿卜素的提取物均展開6 個點:A(Rf=0.235，橙色)、B(Rf=0.364，橙色)、C(Rf=0.411，橙色)、D(Rf=0.652，黃色)、E(Rf=0.727，橙色)、F(Rf=0.838，橙色);而在與之對應的蝦青素標準品的水平位子上有一對應的橙色斑點，其Rf值為0.232，因此可初步判斷樣品中存在蝦青素。為了進一步確證南極磷蝦中含有蝦青素。

圖2 類胡蘿卜素提取物和蝦青素標準品的TLC 圖譜Fig.2 TLC chromatograms of carotenoids extract and astaxanthin standard

本文采用HPLC 來進一步鑒定。蝦青素標準品和南極磷蝦類胡蘿卜素供試液按HPLC 色譜條件進實驗。色譜圖如3 所示:南極磷蝦類胡蘿卜素供試液中相應峰(T=4.30)與蝦青素標準品保留時間(T=4.31)極為接近，經二極管陣列檢測器210～800 nm 紫外掃描表明，二者紫外吸收圖譜極為相似，均在480 nm 處有最大吸收，結合TLC 圖譜分析，判斷南極磷蝦類胡蘿卜素供試液保留時間為4.30 min峰為蝦青素。經檢測，南極磷蝦中蝦青素的含量為0.80 ±0.04 mg/100 g 干樣。

圖3 蝦青素標準品(A)和類胡蘿卜素提取物(B)的HPLC 色譜圖Fig.3 Chromatograms of standard astaxanthin (A)and carotenoids extract (B)

2.4 超臨界CO2 萃取南極磷蝦蝦青素研究

2.4.1 超臨界CO2萃取南極磷蝦蝦油

前期的實驗［8］中，以超臨界CO2萃取南極磷蝦蝦干中的蝦油(圖4)，考察了萃取壓力，溫度和時間對于萃取率的影響。實驗結果表明，萃取壓力，溫度和時間對蝦油萃取效果影響為:壓力＞溫度＞時間。隨著壓力的增加，超臨界CO2流體的密度增加，使得流體的溶解能力增加，同時分子間傳質的距離減少，蝦油與CO2流體之間的傳質效率增加，有利于蝦油的萃取。

圖4 萃取壓力、溫度和時間對南極磷蝦蝦油提取率的影響Fig.4 Effects of extraction pressure，temperature and time on the extraction yield of Antarctic krill oil

蝦青素是南極磷蝦中一種弱極性的脂溶性色素。超臨界CO2萃取蝦青素過程中添加適量的夾帶劑可有效提高蝦青素在CO2流體中的溶解力和選擇性。Krichnavaruk 等人［9］對比討論了夾帶劑添加前后對蝦青素的提取效果的影響，實驗結果顯示夾帶劑添加后，蝦青素的提取效果明顯提高。本實驗采用超臨界CO2萃取法提取南極磷蝦蝦青素，以無水乙醇為夾帶劑，考察了夾帶劑用量，萃取溫度和壓力對于南極磷蝦中蝦青素提取的影響。

2.4.2 夾帶劑用量對南極磷蝦蝦青素得率的影響

固定萃取溫度45 ℃、萃取壓力25 MPa、靜態浸提30 min、動態萃取180 min，考察夾帶劑用量(0.30～1.00 mL/g 樣品)對南極磷蝦蝦青素得率的影響，結果見表1。在萃取壓力、溫度、時間不變的條件下，隨著夾帶劑用量的增加，南極磷蝦蝦青素的得率快速增加，伴隨著時間的延長，增加幅度減小，萃取趨于飽和。這可能是由于夾帶劑的添加，改變了CO2的密度，顯著地改變超臨界CO2流體的極性，同時與蝦青素形成氫鍵或其他特定的化學作用力，大大增加被分離組分在超臨界CO2中的溶解度［10］。隨著夾帶劑用量的增加，樣品萃取近乎飽和，相應溶解度增加效應變緩，所以選擇1.00 mL/g 作為超臨界CO2萃取南極磷蝦蝦青素的最佳夾帶劑用量。

2.4.3 萃取溫度對南極磷蝦蝦青素得率的影響

固定萃取壓力25 MPa、靜態浸提30 min、動態萃取180 min、夾帶劑用量1.00 mL/g 樣品，考察萃取溫度(40～65 ℃)對南極磷蝦蝦青素得率的影響，結果見表1。在萃取壓力，時間和夾帶劑用量不變得條件下，南極磷蝦蝦青素的得率隨著萃取溫度的升高而增加，在60 ℃時達到最大值81. 34 ±1.37%，超過60 ℃時，蝦青素的得率略有下降。超臨界CO2萃取過程中，升高溫度增加了物質的擴散系數而有利于萃取，同時降低了超臨界流體的密度，使物質的溶解度降低而不利于萃取。因此，得率的高低取決于溫度改變后，超臨界流體密度和物質的擴散系數二者之間的相互作用［10］。低于60 ℃時，得率隨著溫度升高而增大，這由于物質的擴散系數增加占主導地位;高于60 ℃時，得率隨著溫度的升高而減小，這由于超臨界流體密度降低占主導地位。此外，蝦青素是熱敏性物質，萃取溫度過高容易導致降解，活性失活。所以選擇60 ℃作為超臨界CO2萃取南極磷蝦蝦青素的最適宜萃取溫度。

2.4.4 萃取壓力對南極磷蝦蝦青素得率的影響

固定夾帶劑用量1.00 mL/g 樣品、萃取溫度60℃、靜態浸提30 min、動態萃取180 min，考察壓力從20～40 MPa 變化對南極磷蝦蝦青素得率的影響，結果見表1。在20～40 MPa 之間，南極磷蝦蝦青素的得率隨壓力的升高而增加，在35 MPa 時達到最大值84.41 ±0.57%。這主要是因為隨著壓力的增加，超臨界CO2流體的密度增加，使得流體的溶解能力增加，同時分子間傳質的距離減少，蝦青素與CO2流體之間的傳質效率增加，有利于蝦青素的萃取。超過35 MPa 后，顆粒之間堆積密度過大，減少了蝦青素與CO2流體的接觸面積及萃取通道［10］，達不到最佳的萃取效果，因此得率略有下降。此外，壓力的增加導致儀器的要求提高，實驗成本的增加，同時也增加了不安全因素。所以選擇35 MPa 為超臨界CO2萃取南極磷蝦蝦青素的最適宜萃取壓力。

圖5 夾帶劑用量(A)、萃取壓力(B)和溫度(C)對南極磷蝦蝦青素得率的影響Fig.5 Effects of the concentration of entrainer (A)，pressure (B)and temperature(C)on the astaxanthin extraction yield of Antarctic krill

2.5 多元逐步回歸模型的建立

SPSS 13.0 軟件中多元逐步回歸模型建立可用于揭示被解釋變量與其他多個解釋變量間的線性關系。逐步回歸分析時，軟件對自變量逐步引進并檢驗、剔除不顯著變量，直到沒有顯著的變量引入回歸方程為止。本研究中，3 個變量夾帶劑用量，萃取溫度和萃取壓力分別以A、B、C 表示，利用SPSS 13.0軟件建立逐步回歸模型，綜合考慮夾帶劑用量，萃取溫度和萃取壓力對南極磷蝦蝦青素得率的影響。

表1 是當各步引入影響最大的變量后對其各自的偏回歸系數的方差分析。在模型1，變量夾帶劑用量(A)引入方程，其偏回歸系數的F =30.026，P(sig.)≈0. 000 ＜0. 01。在模型2，變量萃取壓力(C)引入方程，其偏回歸系數的F=30.422，P(sig.)≈0.000 ＜0.01，可見變量夾帶劑用量(A)，萃取壓力(C)依次被引入回歸方程時對回歸方程的影響均極顯著，變量萃取溫度(B)的偏回歸系數無統計學意義，即對回歸方程影響不大，故未被引入回歸方程。

表2 是當各步引入對回歸方程影響最大的變量時有關的偏回歸系數及t 檢驗。引入變量夾帶劑用量(A)，得第一回歸方程Y =26.388 +49.73A。第二次引入變量萃取壓力(C)，得第二回歸方程Y =4.896 +44.984A +0.952C。變量夾帶劑用量(A)、萃取壓力(C)所對應的P 值分別為0，0.013 均小于0.05，說明它們的回歸檢驗均有顯著性。綜上所述，逐步回歸方程Y =4.896 +44.984A +0.952C 可用于綜合解釋夾帶劑用量，萃取溫度和萃取壓力對南極磷蝦蝦青素得率的影響，其中夾帶劑用量和萃取溫度對蝦青素的提取有著顯著性的影響。

表1 多元逐步回歸模型的方差分析表cTable 1 ANOVA of stepwise multiple regression modelc

表2 多元逐步回歸模型的偏回歸系數及其t 檢驗Table 2 Coefficients of stepwise multiple regression model

3 結論

由以上研究表明，超臨界CO2萃取南極磷蝦蝦青素的適宜工藝條件為:萃取壓力為35 MPa，萃取溫度60 ℃，夾帶劑用量1.00 mL/g，萃取時間3.5 h，蝦青素得率達到84.41 ±0.57%。多元逐步回歸的模型的建立，得到最優模型為Y = 4. 896 +44.984A+0.952C，結果顯示，夾帶劑用量和萃取溫度對蝦青素的提取效果有著顯著性影響。本研究為超臨界超二氧化碳萃取南極磷蝦蝦青素提供基礎理論依據，增加資源的附加值，促進加工企業的發展和漁業資源的可持續利用，使其發揮更大的社會效益和經濟效益。

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