根特異性啟動子的種類和功能

王春燕 王孝坤 李巧玲 謝成建 楊星勇

（重慶師范大學生命科學學院，重慶 401331）

植物根系統是固定植物的根基，是植物吸收水分、無機鹽等的唯一通路，也是合成和貯藏營養物質的重要器官，在植物生命過程中發揮著舉足輕重的作用［1］。根是植物重要的營養器官，針對植物根特異性表達基因的啟動子的研究，為使外源蛋白在植物根中特異表達成為可能［2］。在植物基因工程應用中，根特異性啟動子廣泛應用于抗病基因等在植物根中的特異表達，提高植物抵抗土壤致病菌的侵害能力［3］；耐鹽堿分子機制研究，提高植物對惡劣環境的適應度［4］；甚至改進植物代謝途徑，提高根中營養物質的含量［5］。因此，植物根特異性啟動子的研究對植物基因工程的發展和人類生活水平的提高具有十分重要的意義。

1 源于植物根組織的特異啟動子

植物地下部分所有根的總體稱為根系，雙子葉植物根系大多是直根系，單子葉植物的根系大多是須根系。植物根的結構主要由根冠、分生區、伸長區和根毛區組成。根組織特異表達基因是根特異性表達啟動子的主要來源。依據植物根的不同組成部位以及表達基因的不同，可以將植物根組織啟動子分成5類。

1.1 根毛特異啟動子

根毛的形態發生直接決定于根部根毛細胞（生毛細胞或者H細胞）基因的特異性表達［6，7］。擬南芥棒曲霉素A7基因（At EXPA7、表1序號1）和棒曲霉素A18基因（At EXPA18、表1序號2）是維管植物根組織中普遍存在的一類基因，都包含保守的根毛特異表達元件（RHES），在根毛形態發生過程中特異性表達，協助根毛的發生生長［8］。擬南芥棒曲霉素基因時空特異性表達必需的順式調控元件位于轉錄起始位點上游，在不同根毛類型植株中位置略有不同。在以擬南芥為代表的三型根毛（type 3 root hairs）以及以水稻為代表的二型根毛（type 2 root hairs）中，該元件通常以多拷貝形式存在，在棒曲霉素同源基因中，此元件也普遍存在，并且直接影響到啟動子的活性［8-10］。

表1 用于轉基因研究中的根特異性啟動子

植物根毛的形成，包含根毛凸起的形成和尖端的生長；在這個過程中，伴隨著細胞壁的修整、組裝和裝配。在根毛形成的細胞壁動力學過程中，棒曲霉素參與細胞壁的解離，纖維素合成酶參與細胞壁的組裝，而富含亮氨酸的蛋白以及富含脯氨酸的蛋白則完成細胞壁的裝配［11］。纖維素合成酶基因（At CSLD3、表1序號3）在根毛細胞特異性表達，包含兩個RHES調控元件［10］，在富含亮氨酸蛋白和富含脯氨酸蛋白基因中也是同樣的情況［12］。此外，Won等［13］研究發現，編碼細胞壁解離蛋白的基因EXPANSIN A（EXPA，表1序號4）和EXP B（表1序號5）啟動子中根毛特異表達元件（RHES）也發揮著重要的作用；在禾本科植物中，水稻和大麥的同源EXP B基因的啟動子的近側區域都包含RHES元件，這些啟動子可以指導GFP在根毛的特異性表達；啟動子分段缺失分析顯示RHES元件對于指導基因定位于根毛特異性表達是必須的。

在這些根毛特異性基因啟動子中，啟動子為根毛特異性順式元件所調控，同時也對激素和環境刺激作出應答反應［14］，根毛的發生和延長依賴鈣離子的存在［15，16］，而且光照與否也能夠對根毛特異性基因的表達起到調控作用［9］。目前對棒曲霉素A7基因以及其同源基因已經有了清晰的了解，它的啟動功能和應用潛力在發掘之中。

1.2 根冠基因特異啟動子

植物根冠由薄壁細胞組成，根冠區的細胞壽命短、易脫落，細胞內的高爾基體分泌大量黏液（主要是多糖），在根冠表面形成黏膠層，即為根分泌物，也稱為根際［17］。豌豆果膠酯酶基因（rcpme1、表1序號6）是根冠分泌物編碼基因之一，將rcpme1基因作為根分泌物表達的標志，其啟動子與苯甲氨酸解氨酶（PAL）和根瘤素基因啟動子同源，可以引導gus基因于根冠高水平表達［1］。rcpme1基因啟動子具有十分嚴格的時空調節能力，側翼序列約2.75 kb包含了多種特異性順式作用元件。兩個AC豐富序列CCAAACACCATCCAA和CCAACCACAACA位于-561到-547區及-721到-709區，這兩個序列與維管植物苯甲氨酸解氨酶（PAL、表1序號7）基因的啟動子高度同源，與根瘤素啟動子的同源序列AAAGT和CTCTT出現在4區和11區。此外，TATA盒位于-23到-28區、兩個G盒位于-1 073區、一個I盒位于-58區，這些順式作用元件廣泛分布于rcpme1基因啟動子中，與該啟動子的根冠特異性表達活性密切相關［1］。

根際通過調整根周圍生態結構，對植物的健康生長及產量產生重大影響，鑒定根分泌模式是對根際環境研究的重要突破點［18，19］。rcpme1基因是根尖邊緣細胞與根冠分離過程中的關鍵基因，該基因定位于植物的根尖，并且伴隨著其他根冠分泌物的表達。因此，在已有研究中，將rcpme1基因作為根冠分泌物的分子標記，以此對根冠分泌過程中的不同影響因素的作用效果進行定量分析［20，21］。

近10年來，“根際”這一特殊區域成為研究的熱點，根系分泌物與根際微生物間相生相克關系的研究是其中的一個重要方向［22-26］。Elena等［27］研究發現，根冠特異性基因AtCel5（表1序號8）表達產物是β-1，4-葡聚糖酶，在根穿透土壤的過程中，協助根冠周邊細胞脫落。AtCel5啟動子能攜帶gus基因在根冠細胞和根冠脫落的細胞中特異性表達。因此，AtCel5啟動子可以作為分析根冠細胞生理過程的分子標記，也是研究根冠與環境有益因子相互作用的有力工具。

根冠不僅是根分泌物表達并發揮效能的組織區域，更是植物抵御食根性病蟲害的重要組織［28］。Catherine等［29］利 用MDK4-20（表1序 號9）啟動子在擬南芥和馬鈴薯等植物中表達線蟲干擾肽，MDK4-20啟動子啟動gus基因在根冠細胞中特異性表達，其引導的線蟲干擾肽表達水平與組成型啟動子CaMV35S相比較要高出2倍左右。在MDK4-20啟動子以及其同源啟動子中存在ATATTTAT元件，包含了根特異順式作用元件ATATT。根冠表達特異啟動子可以用來驅動植物抗肽基因在植物根部特異性的表達，針對性的提高了植物對土壤中的病蟲害的抵御能力［30］。

1.3 液泡胞液蛋白基因啟動子

煙草根特異性表達基因TobRB7（表1序號11）是發現較早的根特異性啟動子之一，編碼液泡胞液蛋白，該基因在根分生組織以及根部未成熟區的中心柱區域特異性表達［31］。TobRB7基因啟動子在植物基因工程中應用廣泛。在植物病害研究中，利用轉基因植物特異性表達靶定植物病原物特異基因的dsRNA發夾結構；當病原物通過根部侵染時，將完成對病原特定基因的沉默效應，從而達到對病原體的防治［32］。此外，作為根特異表達的啟動子，TobRB7基因啟動子的應用主要集中在植物根部特異表達基因，研究信號分子在細胞間傳遞方式等［33］。雖然TobRB7啟動子是根部特異表達的理想啟動子，但在啟動效果上沒有CaMV35S啟動子強［34］。

TobRB7基因有諸多同源基因，如FaRB7基因（表1序號10），該基因表達產物是草莓液泡膜嵌入蛋白，在根部特異性表達，在葉柄處有微弱表達。FaRB7基因啟動子中的根特異性調控元件與煙草TobRB7啟動子的同源［31］，FaRB7啟動子在草莓中表現為近根表達，在異源宿主中則表現為組成型表達（如煙草），可作為組成型啟動子CaMV35S的替代［35］。FaRB7基因分析表明，該基因在根中與水的吸收和運輸密切相關，該基因協助維管組織水運輸的完成，因此表現為近根表達［35］。其他液泡胞液蛋白RB7-type TIP的同源基因還有很多，如松葉菊的水通道蛋白基因、向日葵根部的水通道嵌入蛋白基因等［36，37］，這些基因的啟動子在植物根特異性表達研究中都有著諸多應用。

1.4 根特異性糖基轉移酶基因啟動子

根特異性糖基轉移酶基因Atlg73160（表1序號12）的啟動子是從擬南芥中發現提取的，該基因編碼一個根特異性表達的糖基轉移酶，其啟動子可以引導報告基因gus基因在根部全根高效表達［38］。對Atlg73160啟動子序列分析發現，有大量根特異性調控元件位于啟動子上游，如ASF1 MOTIF CAMV、ARFAT、OSE1、OSE2、RAV1AAT、SURE core和TAPOX1等［38］。在半枝蓮Atlg73160基因研究中發現，這些調控元件也參與根特異表達調控過程［39］。Atlg73160基因是糖基轉移酶基因中特異定位于根部表達的基因，可以應用于根部對營養物質攝取的提高，以及植物耐受性方面的應用［38］。

1.5 根特異性磷酸鹽轉運蛋白基因啟動子

磷酸鹽轉運蛋白基因MtPT1和MtPT2（表1序號13、14）發現于蒺藜苜蓿根部，其啟動子可以引導報告基因gus和gfp在擬南芥等植物根部特異性表達［40］。MtPT1和MtPT2基因定位于根部，其表達水平與磷酸鹽缺乏程度成正比。這兩個啟動子有略微不同，MtPT1啟動子啟動基因在根表皮細胞及根毛中表達，MtPT2啟動子引導基因在根表皮、維管柱以及導管組織中表達［41］。啟動子元件分析表明，根特異性調控元件“ATATT”是磷酸鹽轉運蛋白啟動子的重要調控元件。在大麥中發現的磷酸鹽轉運蛋白基因HvPht1和HvPht2（表1序號15、16）屬于Pht1基因家族，在大麥的根部有很強的表達活性；Pht1基因家族的啟動子中都包含一個P1BS（GNATATNC）的磷離子應答元件，表現出強的磷酸鹽敏感性［42］。HvPht1和HvPht2啟動子引導gfp基因在根部特異性表達，尤其是在根毛細胞中，在葉片中也有微量表達［42］，此類啟動子同時具有根表達特異性以及磷酸鹽應答性特點，是植物轉基因工程應用的有力工具。

2 非植物來源的根特異性啟動子

除了從植物自身基因中克隆根特異性啟動子外，非植物基因中也含有大量特異表達的啟動子，它們同樣具有很強的根組織特異表達活性，這類啟動子在應用上可能會發揮出更大的潛能。

2.1 豆血紅蛋白啟動子

豆科植物根部由于根瘤菌侵入根部皮層細胞而形成的瘤狀突起，即為根瘤［43］。在根瘤菌侵染植物根部細胞過程中，血紅蛋白基因pVfLb29（表1序號17）參與根細胞對一氧化氮的解毒，從而防止細胞死亡。在根瘤菌與植物根系共生作用中pVfLb29基因還參與了抑制植物根細胞防御基因啟動的過程［44］。豆血紅蛋白基因pVfLb29能夠在根瘤細胞和菌根真菌叢枝狀細胞中特異性表達，該基因的啟動子在-410到-326區域包含順式調控元件AAAGAT及CTCTT；這兩個調控元件是根瘤細胞表達過程中的必須元件，在其他豆類血紅蛋白基因啟動子中也普遍存在［45］。pVfLb29啟動子-350/-358區域出現的AATATTAAA元件，與黃豆血紅蛋白基因lbc3啟動子（表1序號19）中的調控序列同源，并且在黃豆磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因GmPEPC7的啟動子中，該調控序列也發揮著重要的作用［2］。另外，位于pVfLb29啟動子-410/-326處，有14 bp的回文序列TATTAAA，在GmPEPC7啟動子（表1序號18）中存在相似元件，其特異性表達調控機制也是相似的［46］。

pVfLb29啟動子不僅在根瘤侵染的根細胞中有表達活性，而且在菌根真菌的叢枝狀細胞中也同樣表達［44］，為人們對根瘤特異表達啟動子研究提供了線索和利用的信息。根瘤菌是豆科植物重要的互生真菌，也是農業生產輪作的有利真菌。根瘤特異啟動子在實際生產應用中有很大的利用價值。

2.2 綠豆黃化鑲嵌雙粒病毒啟動子

綠豆黃化鑲嵌雙粒病毒（MYMV）入侵植物的根部，并在根細胞中復制，其單向啟動子TrAP/REn（表1序號20）包含很多根特異表達元件［47-49］。雙粒病毒含有兩個環狀DNA-DNA A和DNA B，它們依賴宿主轉錄機制完成復制［50］。兩基因間隔區域含有調控元件，除了TATA盒和G盒這些必要的元件外，還含有的根特異調控元件包括：ATATT、GCCAC、CTCTT、KCACGW及ROOTMOTIFPOX1等［49］。Shivaprasad等［51］研究發現，可能由于植物葉片中有關蛋白的影響，TrAP/Ren啟動子只能驅動gus基因在根部表達，而在植物的葉片中只有該基因轉錄物的少量積累，所以，TrAP/Ren啟動子呈現出根特異表達特性。另外，該病毒載體對植物沒有毒害影響，而病毒組成型啟動子會對植物造成傷害［52］，因此TrAP/Ren啟動子可以作為植物基因工程中根特異性表達研究的有用工具［49］。MYMV 的TrAP/Ren啟動子的發現和利用為根組織特異性表達研究提供了新的來源，對根特異性表達模式研究是重要補充。

3 展望

近年來，人們在啟動子研究方面展開了大量的工作，不僅克隆了數量豐富的啟動子，而且對其結構和功能有了一定的認識。啟動子不僅直接影響轉入基因的表達水平，而且精細調控其表達的組織特異性［53］。為使目標基因在轉基因植物中有效、準確的表達，啟動子的選擇是關鍵。基于對基因表達調控轉錄水平的研究，需要對其順式作用元件、反式作用因子的特性進行鑒定，進而了解在調控轉錄過程中它們的相互作用關系。作為植物重要的營養器官，關于植物根的研究在不斷的擴展，根特異性啟動子的研究也成為植物根發育和轉基因研究中的重要部分［5］。

目前發現的植物根特異性表達的啟動子并不多，同一啟動子在不同植物間的啟動效率也有差異。下一步的工作可針對啟動子調控元件的分析，探索基因特異性表達調控的分子機理，以期獲得更多有利用價值的根特異性啟動子，有應用價值的啟動子元件也可以投入到實際應用之中。鑒于已發現的根特異性啟動子的調控缺陷，將調控根特異表達的元件組合利用在未來的研究工作中也會成為可能。植物的根關乎植物生長發育的根本，尤其是糧食作物與人類的生產生活關系密切，因此植物根特異性啟動子的研究和應用將帶來巨大的科研價值和商業價值。

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