NaCl脅迫對小麥種子胚在萌發時期蛋白含量的影響

劉向標 牛文婷 段江燕

（山西師范大學生命科學學院，臨汾 041000）

土壤鹽漬化影響著人類的農業生產，生態環境也面臨著嚴峻的挑戰。聯合國糧農組織（FAO）和聯合國教科文組織（UNESCO）對地球土壤進行分析，得出全世界約1.5億hm2的耕地，0.77億hm2受到鹽化的影響［1］。我國的鹽化地約2 000萬hm2，次生鹽化土壤約670萬hm2，約占全國耕地總面積的14%，次生鹽化土壤面積每年以3%的速度擴大［2］。

種子的萌發是植物生長的最關鍵時期，在一定的溫度、水分、濕度條件下萌發時蛋白質的變化反映了植物基因組從休止到開啟的表達情況［3］。近年來出現了大量的有關植物種子萌發時期蛋白質組學研究的文獻報道：Callard等［4］以擬南芥種子為研究對象，分離到1 300多種蛋白質。Fu等［5］對擬南芥做了進一步分析，鑒定出355個獨立基因編碼的437個蛋白點。Yang等［6］對水稻種子萌發進行蛋白質組研究發現，有63種蛋白下調，69種蛋白上調。這些研究中多集中于擬南芥、水稻等植物，而在重要糧食作物小麥中卻少有報道。小麥擁有抗鹽基因［7］，并且有類似的調節途徑和抗鹽因子。

2-DE技術為研究蛋白質的動態變化提供了重要的技術支撐，可以對生物細胞或組織的蛋白質表達進行定量分析，用于揭示不同條件下蛋白質表達的變化情況。該技術具有高通量、高靈敏度、高分辨率、重復性好等優點［8］。蛋白質組學技術在植物種子萌發過程中鑒定出的蛋白質，大部分是這一過程中的下游成分，而不是上游成分［9］。同時在所鑒定的相關蛋白質在數量、種類上還不能組建成詳細的動力學代謝途徑。這些信息的缺乏對我們進一步了解種子萌發機制是遠遠不足的。因此，我們通過識別NaCl脅迫下小麥種子萌發的蛋白含量變化的研究，對真正在蛋白質水平上進行種子萌發的研究有重要的意義。

本研究以“晉麥-47”為研究材料，比較不同濃度的NaCl溶液對小麥種子萌發過程中的抑制作用，確定小麥種子萌發的NaCl濃度傷害閾值和存活閾值。在小麥萌發時28 h（胚根突破種皮2-3 mm）時，把胚和胚乳（包含糊粉層）分離，將胚用于2-DE電泳、考馬斯亮藍染色、PDQuest軟件對其進行研究，將有助于我們進一步從時空變化的角度理解NaCl脅迫下對小麥種子萌發的傷害機制和適應機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 小麥種子 “晉麥-47”由山西省農科院小麥研究所提供。

1.1.2 主要試劑 曲拉通X-100、超純水、蒸餾水、丙酮、過硫酸銨（AP）、尿素、硫脲、十二烷基硫酸鈉（SDS）、三羥基甲基氨基甲烷（Tris）、N、N、N、N-四甲基乙二胺（TEMED）、0.1% HgCl2、牛血清蛋白（BSA）、冰乙酸、甘油、兩性電解質（Bio-Lyte）1%溴酚藍、1 mol/L鹽酸、CHAPS、碘乙酰胺（IAM）、低熔點瓊脂糖、甘氨酸、丙烯酰胺（Acr）、85%磷酸、二硫蘇糖醇（DTT）、95%乙醇、考馬斯亮藍G-250、甲叉雙丙烯酰胺（Bis）。

1.2 方法

1.2.1 不同NaCl濃度對小麥種子萌發的影響 選取干燥度一致、飽滿、種皮色澤正常的種子420粒。（經0.1% HgCl2溶液浸沒消毒2 min后再用純水漂洗5次），置于25 mL純水，鋪有雙層定性濾紙的玻璃培養皿中，每皿60粒蓋上蓋。25℃恒溫避光處理發芽。在7個培養皿內分別加入0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.3和0.4 mol/L濃度的NaCl溶液，實時對培養皿進行稱重補充蒸發的水分，保證各處理組濃度不變。以28 h胚根突破種皮2-3 mm的種子為標準。在4、8、12、16、20、24和28 h隨機取20粒，統計每組的發芽率，每組均重復3次。

1.2.2 取樣 根據不同NaCl濃度對小麥種子發芽率的影響，選出有顯著差異的3個NaCl濃度，分別是0、0.1和0.2 mol/L。選取干燥度一致、飽滿、種皮色澤正常的小麥種子，按照上述方法進行消毒、沖洗、吸去多余的水分后，分別用0、0.1和0.2 mol/L的NaCl溶液中，在25℃恒溫箱中進行避光培養28 h，以胚根突破種皮2 mm為準，進行取樣，將胚和胚乳（包含糊粉層細胞）進行分離。

1.2.3 小麥種子胚中可溶性蛋白2-DE樣品的制備 按照上述3個濃度處理的小麥種子，用尿素/硫脲法提取小麥種子胚蛋白。取出的胚樣品在液氮中磨成粉末加入離心管中，加入尿素/硫脲蛋白提取液振蕩30 s，離心15 min后，取上清液再重復離心，收集上清液，加入3倍體積冷丙酮，并放入-20℃的冰箱里過夜，次日收集沉淀（視具體情況可再加一次，離心同上），4℃放置，使丙酮充分發揮，待沉淀干燥后，溶于400 μL樣品裂解液，4℃冰箱中過夜，第2天離心取上清液，得到蛋白質樣品液，4℃放置待用。

1.2.4 小麥種子胚中可溶性蛋白濃度的定量測定 把牛血清蛋白母液（100 mg/L）配成不同濃度用分光光度計測其OD值，得出標準曲線。再根據測得樣品OD值估算出蛋白樣品的濃度，以此確定后續試驗中加樣量的一致。進行多次重復試驗，減少試驗的偶然性幾率。

1.2.5 小麥種子胚可溶性蛋白的2-DE 取出已經配好的水化上樣液，加入0.001 g DTT，5 μL的40%Bio-Lyte（pH3-10），充分溶解，取均質的水化上樣液與蛋白樣品溶液以4∶1混勻，即為上樣液。采用pH3-10，7 cm線性IPG預制膠條。主動水化在50 V電壓下12 h后，經過250 V 0.5 h、500 V 0.5 h、4 000 V 3 h、最后穩定在4 000 V下進行20 000 Vh，500 V快速保持時間視情況而定。聚焦完畢后，膠條先在平衡液Ⅰ［尿素36 g、SDS 2 g、Tris-HCl（pH8.8）25 mL、甘油20 mL、DTT 0.2 g］中，在搖床上平衡15 min，再在平衡液Ⅱ（0.25 g IAM代替0.2 g DTT，其余組分同平衡Ⅰ）中平衡15 min。然后進行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離膠濃度為12%。

1.2.6 考馬斯亮藍染色 剝離凝膠立即放入固定液（12% TCA）中固定2 h，充分固定后用雙蒸水洗3次，每次5 min，取出放入考馬斯亮藍染液（20%甲醇、1.8%磷酸、8%硫酸銨、0.08%的考馬斯亮藍G250染色至少2 h，脫色液（7%、5%甲醇）脫色1 h后換用雙蒸水進行脫色，直到蛋白點清晰為止。

1.2.7 2-DE圖像分析 凝膠用掃描儀（UMAX）進行掃描，得到蛋白圖像用PDQest軟件進行分析包括背景消減、斑點檢測、匹配、蛋白含量表達分析等。

2 結果

2.1 NaCl脅迫下小麥種子萌發的濃度確定

隨著濃度的增大，未萌發的種子數目的趨勢增強，選出具有代表不同鹽脅迫下的3個NaCl濃度，即0（對照組）、0.1 mol/L（傷害閾值）、0.2 mol/L（存活閾值），作為鹽脅迫下對小麥種子胚蛋白影響的濃度（圖1）。

由圖1可知，通過不同濃度NaCl處理后小麥萌發率均下降。濃度越高萌發率下降的程度越大，對種子的危害程度也越大，這表明NaCl脅迫確實降低了小麥種子的萌發能力。對不同濃度下NaCl對萌發率的影響發現，0 mol/L萌發率為93%、0.05 mol/L萌發率為89%，發現之間的萌發率差異不明顯，說明0.05 mol/L的NaCl對小麥萌發的影響并不明顯，可以把0.05 mol/L視作小麥種子萌發過程中的抗鹽閾值；0.1 mol/L萌發率為68%、0.15 mol/L萌發率為60%，發現萌發率差異不明顯，但是與0 mol/L的萌發率差異顯著，表明這時的濃度已經達到或者超過了小麥種子抗傷害的界限，0.1 mol/L可看作是NaCl溶液對小麥種子的傷害閾值；0.2 mol/L萌發率為27%、0.3 mol/L萌發率為19%，此時的萌發率急劇下降，0.2 mol/L可看作是NaCl溶液對小麥種子存活閾值；0.4 mol/L這個濃度萌發率接近0，可認為0.4 mol/L為致死濃度。根據不同濃度NaCl脅迫下萌發情況，選取了有代表性的3個濃度，分別是0（對照組）、0.1 mol/L（傷害閾值）、0.2 mol/L（存活閾值）作為以下研究的NaCl濃度。本研究討論NaCl脅迫下小麥種子萌發過程中胚蛋白含量的變化，因此致死濃度0.4 mol/L不在本研究的考慮范圍之內。

圖 1 不同濃度NaCl對小麥種子萌發率的影響

2.2 標準曲線繪制

根據改良Bradford方法測定蛋白質含量，并制成標準曲線（圖2）。蛋白質上樣量為0.5 mg。由圖2可見，牛血清蛋白的含量與在595 nm的OD值呈線性相關。

圖2 標準牛血清蛋白曲線

由圖2標準曲線公式可以得出：0.1 mol/L NaCl時 樣 品 的OD值 為0.207，濃 度 為1.096 μg/μL；0 mol/L NaCl時樣品的OD值為0.202，濃度為1.07 μg/μL；0.2 mol/L NaCl時樣品的OD值為0.197，濃度為1.045 μg/μL。

2.3 不同鹽脅迫濃度下提取胚蛋白進行SDS-PAGE所得凝膠膠圖像

為了進一步確定鹽脅迫下影響小麥種子蛋白含量的濃度，分別提取7個濃度下的小麥胚蛋白樣品100 μg進行SDS-PAGE（圖3）。從圖3可以清晰地看到隨著鹽脅迫濃度的上升，在凝膠上出現的蛋白條帶出現的變化，充分說明鹽脅迫確實對小麥胚的蛋白含量產生了影響。

圖3 不同濃度的鹽脅迫對小麥種子胚蛋白的SDS-PAGE

2.4 不同NaCl濃度處理后小麥種子胚差異蛋白變化

選取0、0.1及0.2 mol/L濃度的NaCl處理過的小麥種子露白時期的小麥胚蛋白100 μg，選用10 cm pH3-10的非線性膠條對上述的材料進行雙向電泳。3種濃度的蛋白樣品都進行3次重復操作。重點檢測變化點，用來了解不同NaCl濃度處理對小麥種子萌發過程中蛋白質變化的影響。2-DE上的污點的灰度和位置的變化可以理解為蛋白質點的降解、合成或翻譯后修飾。以0 mol/L NaCl處理的種子胚作為參考膠與其他兩塊膠0.1 mol/L NaCl脅迫、0.2 mol/L NaCl脅迫，通過用PDQuest8.0進行比對分析發現：在檢測到的種子胚中以0 mol/L 時為對照膠約有蛋白點121個（圖4）；0.1 mol/L NaCl脅迫下（圖5）有117個，其中有32個蛋白點豐度下調，21個蛋白點豐度上調，其中包括10個表達消失的點，3個新表達的點；在0.2 mol/L NaCl脅迫下（圖6）有102個蛋白點，檢測到46個蛋白質點豐度下調，16個蛋白點的豐度上調，其中包括16個表達消失的點，7個新表達的點。為了使差異蛋白點更清楚的觀察，對部分變化的蛋白點進行了放大（圖7）。

3 討論

3.1 鹽脅迫條件下NaCl濃度的選擇

圖4 0 mol/L NaCl脅迫下小麥種子2-DE圖譜

圖5 0.1 mol/L NaCl脅迫下小麥種子2-DE圖譜

圖 6 0.2 mol/L NaCl脅迫下小麥種子2-DE圖譜

從不同NaCl濃度對小麥種子萌發率影響來看，明顯地呈現出隨著濃度的升高未萌發的種子數量的趨勢加強。同時，對各濃度下小麥種子蛋白的SDSPAGE上更顯著地體現出圖一相同的特點，即0和0.05 mol/L之間，0.1 mol/L和0.15 mol/L之間，0.2 mol/L和0.3 mol/L之間對種子萌發的脅迫程度相近。因此，從中選出具有代表不同鹽傷害程度的3個NaCl濃度，即0（CK對照）、0.1 mol/L（傷害閾值）、0.2 mol/L（存活閾值），作為本研究的NaCl處理濃度。因本研究只討論NaCl脅迫下萌發種子的胚蛋白含量的變化，所以致死濃度0.3 mol/L不在選擇范疇內。

圖 7 不同濃度鹽脅迫下小麥種子萌發過程中胚蛋白部分放大的差異蛋白點

3.2 雙向電泳分析差異蛋白

植物的整個生命活動周期中，種子的萌發過程是一個異養過程。對不同濃度處理后的小麥種子，很清楚地發現鹽脅迫延遲了小麥種子的萌發。植物在受到非生物脅迫的時候，有些蛋白在萌發的過程中表達豐度上調了，這體現了植物體內會誘導產生一些新蛋白質或原有的蛋白含量的明顯增加以適應逆境脅迫。本試驗中NaCl脅迫下處理的小麥種子，其胚蛋白的凝膠圖譜與正常的不同，說明NaCl脅迫處理影響了小麥種子胚中蛋白含量和組分。這與前人的研究結果一致。在鹽脅迫、臭氧等外界因素的脅迫下，小麥種子中SAM基因的表達增強［10］。大麥、玉米、擬南芥種子中LEA蛋白質豐度的降低程度與種子處于寒冷和干旱脅迫有關［11］，LEA蛋白能夠通過束縛水分子來保護萌發中的活性組織，進而起到穩定蛋白的作用。鹽脅迫下水稻、擬南芥中PSCS基因的轉錄水平提高了5倍［12］，說明PSCS基因可被鹽脅迫下誘導表達。山梨醇和海藻糖等也都是細胞滲透調節時產生的重要的可溶性物質，有利于增強植物的耐鹽性［13］，超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）等在清除鹽脅迫情況下產生的有害物質起到重要作用，同時，在轉基因植物中也發現保護植物組織的相關蛋白表達含量提高了植物的耐鹽性［14-16］。本研究中通過對不同濃度鹽脅迫下2-DE分析發現，蛋白含量有下降和上升，也出現一些新蛋白。我們推測，這些變化都是植物體調節自身的理化反應，從而減緩鹽脅迫情況下給機體帶來的損傷。脅迫影響了胚正常發育過程中蛋白質的表達，并隨脅迫程度的加強而加大。無規律變化上調的蛋白質，多是種子萌發過程中新產生的蛋白質，下調蛋白質是成熟種子原來貯藏的蛋白或是原有的mRNA翻譯來的，對上調點和下調點影響的不同，說明鹽脅迫的危害主要是由于影響了種子萌發過程中新蛋白的表達模式。

4 結論

代表不同鹽傷害程度的3個NaCl處理濃度，即0 mol/L（CK對照）、0.1 mol/L（傷害閾值）、0.2 mol/L（存活閾值）；在該處理濃度下，既有新的蛋白質的出現，也有原蛋白子含量的增加和減少。檢測到正常的種子胚有121個點，0.1 mol/L NaCl脅迫下有32個蛋白點豐度下調，21個蛋白點豐度上調，其中包括10個表達消失的點，3個新表達的點；在0.2 mol/L NaCl脅迫下，檢測到46個蛋白質點豐度下調，16個蛋白點的豐度上調，其中包括16個表達消失的點，7個新表達的點。

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