中國林蛙核糖核酸酶Rdrlec的原核表達及抗菌活性檢測

尹雪薇 彭艷麗 冉帥 陶鳳云

（北京聯合大學生物化學工程學院，北京 100023）

近年來，抗菌及抗腫瘤的核糖核酸酶作為多功能分子引起了廣泛的關注，這方面的研究相當活躍，成為新藥開發的熱點［1-4］。來源于家雞（Gallus gallus）的兩個RNase A超家族成員RNase A-1和A-2具有81%氨基酸序列一致性，等電點分別是10.2和11.0，其中具有較高等電點的RNase A-2具有顯著的殺菌活性，而RNase A-1沒有殺菌活性。進一步的研究發現，RNase A-2中的兩個結構域，Domain II（TTRRHFRIT）和Domain III（RYSGNQFNRRVRVGCRG）對該分子的殺菌活性具有重要貢獻，可以不依賴于分子骨架而以單獨肽段形式發揮殺菌活性［5］。來源于魚類的多個RNase A超家族成員都發現具有殺菌活性［6，7］，大腸桿菌外膜蛋白酶OmpT可以特異性地裂解斑馬魚ZF-RNase-3分子中的Arg-Arg肽鍵，釋放出2個肽段，其中的大片段（氨基酸31-124）是有效的殺菌劑［8］。中國林蛙核糖核酸酶Rdronc分子中處于正選擇壓力下的帶有正電荷的氨基酸殘基對于殺菌活性具有重要作用［2］。由于核糖核酸酶A（ribonuclease A，RNase A）超家族成員數量眾多，氨基酸序列變異很大，有假說認為該超家族成員可能起源于宿主防御功能［6］，驗證這一假說需要來源于不同物種的多種RNase A超家族成員具有殺菌活性的試驗數據。

中國林蛙核糖核酸酶Rdrlec基因是本實驗室從中國林蛙基因組中PCR擴增得到的495 bp的核苷酸片段，包含信號肽序列和完整的成熟蛋白編碼區序列。Blast檢索顯示此序列與多條來源于蛙屬的核糖核酸酶同源，其中與來源于日本蛙的核糖核酸酶Rjlec （protein ID：P18839），具有最高的氨基酸序列一致性（81%），我們將新基因命名為Rdrlec，提交到GenBank （登錄號EU384704）。

為了進一步開發利用這一新的基因資源，探索其編碼的蛋白產物的生物學活性，我們將此基因按照大腸桿菌偏好的密碼子進行優化后，人工合成基因，定向克隆到pET-28a（+）構建重組表達載體，在大腸桿菌BL21（DE3）中誘導表達融合蛋白。通過包涵體復性、腸激酶切割融合蛋白、Ni-NTA親和層析純化等步驟獲得了野生型Rdrlec重組蛋白，并檢測其抗微生物活性，旨在為該分子的進一步開發應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

表達載體pET-28a （+）、大腸桿菌DH5α、BL21（DE3） 、藥敏測試大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均由北京聯合大學生物化學工程學院生物工程實驗室保藏；Pfu DNA 聚合酶、DNA 片段純化試劑盒均購自北京賽百盛基因技術有限公司；T4 DNA 連接酶、限制性內切酶EcoR I和Hind III等購自寶生物工程（大連）有限公司；質粒提取試劑盒、瓊脂糖膠回收試劑盒、異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）購自天根生化科技（北京）有限公司；LB 培養基購自美國BD公司；Ni-NTA介質購自Qiagen；重組腸激酶購自Novagen公司。TritonX-100 購自Sigma 公司；其他試劑為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 Rdrlec基因序列的優化、合成與PCR擴增 根據大腸桿菌密碼子的偏好性及密碼子的合理搭配設計Rdrlec的基因序列，在基因的N端添加腸激酶裂解位點，在C端添加連續2個終止密碼子，在上述序列的兩端分別引入EcoR I和Hind III限制性內切酶識別位點。設計的核苷酸序列由生工生物工程（上海）有限公司合成，并克隆在pUC57質粒上，命名為pUC57-Rdrlec，保存在大腸桿菌DH5α中。

根據以上的序列設計兩條特異性PCR擴增Rdrlec的引物：5'-CCCGAATTCGACGATGATGACAAACAG-3'和5'-GGCAAGCTTGTCATTAACAGCTACCG-3'，下劃線部分依次為EcoR I和Hind III限制性內切酶位點，其兩側添加了保護性堿基以提高限制酶切割效率。引物由北京賽百盛基因技術有限公司合成。

以pUC57-Rdrlec為模板，PCR擴增Rdrlec基因片段，PCR條件為：94℃ 預變性5 min；94℃30 s、55℃ 30 s、72℃ 50 s，共進行35 個循環；最后72℃延伸10 min。將PCR產物進行3. 0% 瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠回收試劑盒回收目標基因片段。

1.2.2 重組原核表達載體的構建 將純化回收的PCR產物和pET-28a （+）載體均用EcoR I和Hind III雙酶切，酶切產物電泳分離并切膠純化后，使用T4 DNA 連接酶在16℃連接過夜，連接產物轉化大腸桿菌BL21（DE3）感受態細胞，卡那霉素篩選陽性克隆。提取質粒，分別用EcoR I單酶切重組表達載體，及用EcoR I和Hind III雙酶切重組表達載體，進行酶切驗證后，重組質粒命名為pET28a-Rdrlec，送北京三博遠志生物技術有限公司進行測序驗證。

1.2.3 重組融合蛋白的誘導表達 將測序正確的表達質粒轉化大腸桿菌BL21（DE3）感受態細胞，獲得工程菌BL21（DE3）/ pET28a-Rdrlec。挑單菌落接種于LB培養液（50 μg/mL卡那霉素），37℃振蕩培養過夜，按10%轉接到含有卡那霉素的新鮮液體培養基中，37℃振蕩培養至OD600為0.8時，加入IPTG使其終濃度為0.5 mmol/L，降低培養溫度至34℃，誘導6 h后，8 000 r/min離心15 min收集菌體，用PBS洗3次，取少量樣品采用SDS-PAGE （5%分離膠，15%濃縮膠）檢測重組蛋白表達情況。

1.2.4 重組融合蛋白的純化 離心收集細胞，洗滌去除培養基，將菌體重懸于裂解液（20 mmol/L Tris·HCl （pH8.0），0.5 mmol/L EDTA，50 mmol/L NaCl，0.5% Triton X-100）中，在冰浴條件下超聲破碎菌體（超聲5 s，間隔5 s，50 次循環，功率300 W），接著4℃、15 000 r/min離心30 min收集包涵體。將包涵體用洗滌液［1%（V/V）Triton X-100，1 mol/L NaCl］充分洗滌后，溶于尿素變性緩沖液（8 mol/L Urea，50 mmol/L Tris，pH7.5，25 mmol/L DTT）中，室溫下溶解2 h。離心除去沉淀，將蛋白濃度控制在50 μg/mL，在復性緩沖液（含有 0.10 mol/L NaCl，3.0 mmol/L 還原型谷胱甘肽，0.6 mmol/L 氧化型谷胱甘肽的 0.10 mol/L Tris-乙酸緩沖液，pH8.0）中4℃復性40 h。

離心收集上清，用超濾管濃縮（截流相對分子質量3 kD）后，透析，進行Ni-NTA親和層析，用60 mmol/L咪唑充分洗去雜蛋白后，用500 mmol/L咪唑洗脫目標融合蛋白。

1.2.5 腸激酶切割融合蛋白釋放Rdrlec 將純化的融合蛋白透析后，利用腸激酶進行酶切，以釋放Rdrlec。反應體系為：10×rEK Cleavage buffer 5 μL，融合蛋白50 μg，重組腸激酶4 μL（1 U/μL），去離子水補充至總體積50 μL，25℃溫浴酶切反應24 h，取樣SDS-PAGE分析酶切效果。將酶切后的溶液上樣于Ni-NTA柱，載體序列由于帶有6×His標簽，特異性吸附到層析介質上，而Rdrlec存在于穿過液中。收集Rdrlec部分，透析并凍干濃縮后，再次進行Sephadex G75層析純化Rdrlec。進行15% SDSPAGE檢測酶切和純化效果。

1.2.6 Rdrlec的酶活性 參考文獻方法［2，9］，酶活性的檢測基于核糖核酸酶降解酵母總RNA的反應。將純化的酵母總RNA底物溶解在反應緩沖液（40 mmol/L乙酸鈉，pH6.0）中。反應總體積為0.8 mL，含有0.8 mg RNA底物。將重組Rdrlec加入到反應體系中，37℃反應4 h，然后添加0.5 mL冰冷的20 mmol/L硝酸鑭和3%高氯酸終止反應。在室溫下13 000 r/min離心除去未降解的RNA，通過OD260值檢測溶解于上清液中的RNA降解產物的量，分別以RNase A和乙酸鈉緩沖液作為酶活性檢測的陽性對照和陰性對照。

1.2.7 Rdrlec的抗菌活性 將斜面保存的Escherichia coli和Staphylococcus auteus分別進行LB固體平板劃線，挑取單菌落接種到LB液體培養基中，置于37℃搖床中培養至指數生長期后，連續10倍稀釋涂平板進行菌落計數，調整菌液濃度為（1-5）×106作為測試菌液。取不同濃度的重組蛋白用10 mmol/L pH7.4的磷酸鈉緩沖液連續10倍稀釋后取5 μL 加入到20 μL 菌懸液中，對照組加入等量的磷酸鈉緩沖液。37℃培養4 h，使重組蛋白發揮殺菌作用。處理后的菌懸液連續10倍稀釋，涂LB瓊脂平板，做3個重復，37℃過夜培養后計數菌落形成單位，計算細菌存活數，并繪制曲線。

2 結果

2.1 Rdrlec基因的優化與PCR擴增

由于Rdrlec基因（GenBank EU384704）來源于兩棲動物蛙類含有大腸桿菌稀有密碼子，會影響其在大腸桿菌中的高效表達，首先使用稀有密碼子計算 器（Rare Codon Calculator，http：//nihserver.mbi.ucla.edu/RACC/）對Rdrlec成熟肽對應的基因序列進行分析，發現序列中共有10個稀有密碼子（5個精氨酸稀有密碼子，3個異亮氨酸稀有密碼子和2個脯氨酸稀有密碼子），如圖1中下劃線所示。為了提高重組蛋白的表達量，對該序列進行了優化，原則是首先根據表達物種的密碼子頻率進行調整，以使基因序列的密碼子使用頻率盡可能的與物種的最優密碼子頻率一致，去掉了頻率在10%以下的密碼子；然后盡可能降低序列中的堿基重復結構，使RNA二級結構相對簡單、穩定；同時使整個DNA序列的G+C含量盡可能接近50%。優化后的序列與優化前序列比對結果如圖1。

分別在優化后的Rdrlec基因的N端添加腸激酶裂解位點 （DDDDK）及在C端添加連續2個終止密碼子 （TAATGA），可以使表達出的融合蛋白經過腸激酶裂解后得到具有天然N 末端和C末端的重組蛋白；在上述序列的兩端分別引入EcoR I和Hind III限制性內切酶識別位點，可使該基因片段定向連接到pUC57載體相應的多克隆位點處。以pUC57-Rdrlec為模板，利用高保真Pfu DNA聚合酶和目的基因特異性引物PCR擴增出目的基因片段，其分子量大約為370 bp（圖2），與理論值相符。

圖1 密碼子優化前后的序列比對

圖2 PCR擴增目標基因

2.2 重組表達載體的構建

1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果（圖3）顯示，重組表達載體pET28a-Rdrlec大小約為5 700 bp，雙酶切后得到約5 350 bp的載體大片段和約360 bp的目的基因片段，片段大小與理論值相符，初步表明表達載體構建成功。測序結果顯示載體中的基因序列和設計序列完全一致，且閱讀框架正確，重組表達載體pET28a-Rdrlec構建成功。

圖3 EcoR I 和Hind III雙酶切鑒定重組表達載體pET28a-Rdrlec

2.3 重組融合蛋白的誘導表達與純化

將測序正確的重組表達載體pET28a-Rdrlec轉化到表達宿主菌BL21（DE3），在含有50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養基中培養至OD600達到0.8時，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，并降低誘導溫度至34℃誘導重組融合蛋白表達，分別取誘導0 h和6 h的菌液，SDS-PAGE分析表達產物（圖4），誘導6 h后的工程菌在約17 kD處有一條明顯的新生的重組蛋白表達條帶，與重組融合蛋白的預期分子量值（16.7 kD）相符，而未誘導的工程菌在相應位置處無相應的蛋白條帶。分析菌體經超聲波裂解后的上清和沉淀（圖4中泳道6，7），可見重組蛋白大部分分布在沉淀中，以包涵體形式表達。

SDS-PAGE顯示（圖4中泳道3），Ni-NTA親和層析后重組融合蛋白得到了有效的純化。

將純化后的融合蛋白用腸激酶裂解，釋放Rdrlec蛋白，電泳結果（圖4中泳道4）顯示，酶切效果理想，釋放出分子量約12.3 kD的Rdrlec蛋白和分子量約4.4 kD的載體融合肽。腸激酶裂解產物再次進行Ni-NTA親和層析，由于載體融合肽帶有6×His標簽而結合在層析介質上，而Rdrlec蛋白則流出層析柱。將流出液中的Rdrlec蛋白透析后凍干，溶解于pH6.0 的40 mmol/L乙酸鈉緩沖液中，電泳顯示（圖4中泳道5），Rdrlec重組蛋白得到了有效的純化。

圖4 重組蛋白表達及純化產物電泳檢測

2.4 Rdrlec的酶活性

重組Rdrlec具有酶活性，其酶活性弱于RNase A，但是顯著高于乙酸鈉陰性對照組（圖5）。由于核糖核酸酶的活性依賴于分子正確的空間結構，因此可以推測Rdrlec重組蛋白已經正確折疊。

2.5 Rdrlec重組蛋白的抗菌活性

Rdrlec重組蛋白對測試的兩種菌均具有顯著的抗菌活性（圖6），其中對大腸桿菌抑制作用最強，在Rdrlec重組蛋白濃度為2 μmol/L時，菌落數下降約5個數量級。對金黃色葡萄球菌的抑制作用其次，菌落數下降約3個數量級。

圖5 Rdrlec重組蛋白的酶活性與RNase A比較

圖6 Rdrlec重組蛋白的抗菌性

3 討論

為了探索Rdrlec這一新基因編碼的蛋白產物的功能，我們利用基因工程技術在大腸桿菌中表達重組蛋白。由于有活性的重組蛋白在表達過程中可能對宿主細胞有毒害，因此采用包涵體形式表達。包涵體主要由目的蛋白構成的，但是由于錯誤折疊形成無活性、不溶的蛋白聚集體，包涵體與細胞質成分明顯分開，細胞破碎之后仍以顆粒形式存在。包涵體內絕大多數成分是蛋白質，雜質主要是一些外膜蛋白、質粒DNA、核糖體元件、脂質、肽聚糖和脂多糖等。包涵體的形成對于重組蛋白的生產提供了幾個有利的因素：包涵體具有高密度，易于通過低速離心分離純化；包涵體有較強的抗酸堿、抗蛋白酶的能力，有利于保護重組蛋白免受外界強烈作用的破壞而降解損失；可用于生產天然構象時對宿主細胞有毒害的蛋白質。

由于基因表達水平與偏好密碼子的使用程度之間存在強的相關性，因此為了提高重組蛋白的表達效率，我們采用大腸桿菌偏好密碼子進行了基因全序列優化和人工合成。同時，由于天然N 端對抗菌肽的生物活有決定性作用，為了保證所表達的重組蛋白具有天然N 端，我們在抗菌肽基因的N 端添加了腸激酶識別序列。

本研究表達出的中國林蛙核糖核酸酶Rdrlec重組蛋白具有明顯的抗菌作用，對革蘭氏陽性菌和陰性菌表現出不同的抗菌活性，這可能與細菌細胞的表面結構組成有關。不同的細菌外膜組成上存在差異，使表面的負電荷表現差異，對同一種蛋白的結合能力造成差異［10］。抗菌蛋白必需穿過胞外基質、細胞壁肽聚糖層等到達細胞質膜。按照膜裂解型或非膜裂解型方式作用質膜［11］，目前發現的絕大多數抗菌蛋白是通過損傷質膜的膜裂解型方式作用于細胞。抗菌蛋白的正電荷啟動與質膜的結合，雙親α螺旋或β折疊的結構進一步實現對膜脂雙層的插入或破壞。

中國林蛙核糖核酸酶Rdrlec作為一種有效的抗菌蛋白，為抗微生物感染提供了新的候選藥物分子，在醫藥、食品防腐和動物飼料添加劑等領域可能具有應用的潛力。

4 結論

按照大腸桿菌偏好的密碼子合成Rdrlec基因，并在目的基因的N端添加腸激酶切割位點，同時在C端添加終止密碼子，通過EcoR I和Hind III限制性內切酶位點將目的基因定向克隆到pET-28a（+）表達載體中，在大腸桿菌BL21（DE3）中表達出帶有6×His標簽的融合蛋白，利用Ni-NTA親和層析純化融合蛋白后，經過腸激酶切割，獲得具有抗菌活性的不帶有額外氨基酸序列殘留的Rdrlec重組蛋白，重組蛋白具有水解RNA的酶活性，說明形成了正確的空間結構，重組蛋白對對測試的革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性大腸桿菌均具有顯著的抗菌活性，提示中國林蛙核糖核酸酶Rdrlec可能在抗微生物感染中發揮作用。

［1］ 陶鳳云, 趙偉, 馬潤宇. 核糖核酸酶A超家族成員殺菌作用研究進展［J］. 中國抗生素雜志, 2009, 34（6）：321-325, 379.

［2］ Tao F, Fan M, Zhao W, et al. A novel cationic ribonuclease with antimicrobial activity from Rana dybowskii［J］. Biochem Genet, 2011, 49 （5-6）：369-384.

［3］ 陶鳳云, 趙偉, 林強, 等. 中國林蛙卵核糖核酸酶的分離純化及其抗腫瘤作用［J］. 中國生物工程雜志, 2010, 30（5）：103-109.

［4］ Lee I. Ranpirnase （Onconase）, a cytotoxic amphibian ribonuclease, manipulates tumor physiological parameters as a selective killer and a potential enhancer for chemotherapy and radiation in cancer therapy［J］. Expert Opin Biol Ther, 2008, 8 （6）：813-827.

［5］ Nitto T, Dyer KD, Czapiga M, et al. Evolution and function of leukocyte RNase A ribonucleases of the avian species, Gallus gallus［J］. J Biol Chem, 2006, 281：25622-25634.

［6］ Cho S, Zhang J. Zebrafish ribonucleases are bactericidal：implications for the origin of the vertebrate RNase A superfamily［J］. Mol Biol Evol, 2007, 24 （5）：1259-1268.

［7］ Pizzo E, Varcamonti M, Di Maro A, et al. Ribonucleases with angiogenic and bactericidal activities from the Atlantic salmon［J］. FEBS J, 2008, 275 （6）：1283-1295.

［8］ Zanfardino A, Pizzo E, Di Maro A, et al. The bactericidal action on Esch-erichia coli of ZF-RNase-3 is triggered by the suicidal action of the bacterium OmpT protease［J］. FEBS J, 2010, 277：1921-1928.

［9］ Rosenberg HF. Recombinant human eosinophil cationic protein. Ribonuclease activity is not essential for cytotoxicity［J］. J Biol Chem, 1995, 270 （14）：7876-7881.

［10］ Papo N, Shai Y. Can we predict biological activity of antimicrobial peptides from their interactions with model phospholipid membranes? ［J］. Peptides, 2003, 24 （11）：1693-1703.

［11］ Powers JP, Hancock RE. The relationship between peptide structure and antibacterial activity［J］. Peptides, 2003, 24 （11）：1681-1691.