決明查爾酮合成酶全長基因序列的克隆與分析

鐘德馨 方袁夢夢 郭壯浩 安紅強 董銀松 丁若凡 王萬軍 廖海 周嘉裕

（西南交通大學生命科學與工程學院，成都 610031）

真核生物基因的一個基本特征是它們被一個或多個內含子所間隔，這些內含子在轉錄后被除去以形成具有完整讀碼框的mRNA。盡管真核生物基因翻譯后獲得的蛋白質序列中不含有內含子的信息，但是內含子的存在對基因表達有著積極的作用，能夠促進基因轉錄、促進mRNA的翻譯、參與基因的差異表達，是真核生物基因表達調控的重要元件之一。

黃酮類化合物是一類重要的植物次級代謝產物，在植物花色形成、植物育種、低抗紫外線輻射、防止病原微生物侵染中都發揮了重要作用。并且，黃酮類化合物還具有預防心血管疾病、抗癌、調節免疫、抗衰老、抗菌、抗炎等多種生物活性，是一些藥用植物的主要活性成分［1，2］。查爾酮合成酶（Chalcone synthase，CHS）是植物中黃酮類化合物合成途徑的關鍵酶，是調控植物黃酮類化合物代謝的關鍵基因之一。CHS催化黃酮類化合物生物合成途徑的第一步，丙二酸單酰CoA與香豆酰CoA縮合成查耳酮的反應［3］。目前，已從等多種植物中克隆了CHS基因，包括百合花、紫葉李、大豆、金魚草和擬南芥等［4-7］。

雖然對植物CHS基因的克隆已有一些報道，但對相關基因的全長、外顯子和內含子構成及其所屬的CHS基因家族的分子進化研究得卻較少。決明（Cassia tora）為豆科草本植物，其干燥成熟種子被稱為決明子。決明子是一種常用的中藥，有效成分主要是蒽醌類及黃酮類化合物［8］。為研究決明CHS基因的結構、進化及表達調控機制，本研究在前期已獲得決明CHS基因的全長cDNA的基礎上［9］，首次從決明子葉中克隆得到決明CHS基因的全長序列，分析該基因的外顯子和內含子區域，并對內含子中可能的調控位點進行了預測。在此基礎上，利用CHS基因構建系統進化樹，展開進化分析，確定CHS基因是否能用于分析植物的遺傳分化和分子進化研究問題。

1 材料與方法

1.1 材料

決明種子購自成都市中藥公司，用MS培養基培養種子，取萌發的子葉作試驗材料。

大腸桿菌BL21，表達載體pET28a（+）由作者所在實驗室保存。測序載體pMD19-T載體（衍生自pUC-19，Ampr）、ExTaq DNA聚合酶，dNTP、氨芐青霉素、限制性內切酶、T4連接酶、DNA Marker DL2000均為大連寶生物工程有限公司產品；胰蛋白胨和酵母提取物購自OXIOID公司；瓊脂糖和瓊脂粉為Amersham產品；其余試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 決明子葉基因組的制備 取決明子葉0.1 g，加液氮研磨成粉末，用北京百泰克生物有限公司的植物基因組DNA提取試劑盒對決明子葉基因組進行提取，具體步驟按說明書進行。瓊脂糖凝膠電泳分析DNA質量。

1.2.2 引物設計與合成 應用Primer Premier 5.0引物設計軟件，根據我們在GenBank中發表的決明CHS（GenBank登錄號：EU430077）基因序列在CHS基因上下游設計1對引物。該對引物理論跨幅包括決明CHS基因的開放閱讀框序列1 173 bp，由上海英俊生物技術有限公司合成。引物序列，如表1。

表1 PCR擴增所用引物序列

1.2.3 決明查爾酮合成酶基因的擴增 以決明子葉基因組為模板，利用PCR從中擴增出決明CHS基因序列，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。PCR反應體系為DNA 溶液1 μL，LA Taq酶（5 U/μL）0.3 μL，10×LA Taq Buffer 4.0 μL，MgCl2（25 mmol/L）1.0 μL，dNTPs（各2.5 mmol/L）2.5 μL，上下游引物各（20 μmol/L）1.0 μL，ddH2O 14.2 μL。混勻后，于Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler PCR儀上進行PCR擴增。反應程序：95℃ 4 min；94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 4 min，35個循環；72℃ 10 min，4℃，保存。

1.2.4 PCR 產物克隆與測序 采用百泰克生物公司的多功能DNA純化回收試劑盒對PCR產物進行回收。將回收的DNA產物連接到pMD19-T載體上。將連接產物轉化E. coli DH5α感受態細胞，在含有50 mg/mL氨芐青霉素的LB瓊脂平板培養基上37℃培養16 h。挑取該平板中的成熟陽性單菌落，進行菌落PCR鑒定，反應體系包含：上下游引物各1 μL；dNTP（2.5 mmol/L）2 μL；MgCl2（2.5 mmol/L）1.5 μL；10×Ex Taq PCR buffer 2.5 μL；Ex Taq酶（5 U/μL）0.2 μL；加ddH2O至25 μL，反應條件與之前相同。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。再挑取相應的單陽性菌落接種于含氨芐青霉素（50 mg/L） 的液體LB 培養基中，37℃振蕩培養12 h，由三博科技有限公司進行測序。

1.2.5 CHS基因序列分析 將測序結果用在線軟件Spidey（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/IEB/Research/Ostell/Spidey）進行分析，再用DNAMAN4.0軟件與決明cDNA序列進行序列比對，獲得內含子序列，并對內含子的酶切位點進行分析。使用在線分析軟件CDD（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrp sb.cgi）與PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）分別對外顯子2的保守功能結構域和內含子中的調控序列進行分析。從NCBI資源庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中選取矮牽牛（Petunia hybrida，GenBank登錄號：X14591.1），百合（Lilium hybrid division，GenBank登錄號：HM-622754.1），大豆（Glycine max，GenBank登錄號：M-98871.1），黃芩（Scutellaria baicalensis，mRNA Gen-Bank登錄號：AB008748.1，intron GenBank登錄號：EU814894.1），金 蕎（Fagopyrum dibotrys，GenBank登錄號：GU169470.1），苦蕎（Fagopyrum tataricum，GenBank登錄號：HQ434624.1），擬南芥（Arabidopsis thaliana，mRNA GenBank登 錄 號：NM_121396.3，全基因GenBank登錄號：NM_121396.3），日本水稻（Oryza sativa，mRNA GenBank登錄號：AB000801.2，全基因GenBank登錄號：AC134256.4），紫葉李（Prunus cerasifera，GenBank登 錄 號：DQ856583.1，內含子參考文獻［5］），歐洲赤松（Pinus sylvestris，GenBank登錄號：X60754.1）等植物的CHS基因，用Clustalx1.8和MEGA4軟件分別對外顯子和內含子構建NJ系統進化樹，展開進化分析。

2 結果

2.1 基因組質量分析

由圖1-A左可以看到從決明子葉中提取得到的DNA分子量在2 kb以上，無RNA和蛋白質污染。能夠用于下一步的PCR擴增。

2.2 決明CHS基因的克隆

根據GenBank登錄的決明CHS基因序列的保守區域設計1對特異引物，并進行PCR擴增，擴增的特異性比較好，獲得了近2 000 bp的清晰條帶（圖1-B）。將該條帶回收后，連接到pMD19-T載體上，并轉化E. coli DH5α感受態細胞，在含有氨芐青霉素的LB瓊脂平板培養基上培養。挑取該平板中的成熟陽性單菌落，菌落PCR鑒定陽性單菌落中含有2 000 bp的目的條帶，結果見圖1-C。

圖1 電泳結果

2.3 生物信息學分析結果

2.3.1 決明CHS的DNA全長分析 將含有2 000 bp目的條帶的單菌落進行測序，測序得到的CHS基因的起始序列為ATG，終止序列為TGA，全長為1 766 bp，含有1個長度為1 173 bp的完整開放閱讀框（open reading frame）。將其提交GenBank，登錄號為（JX676773）。利用Spidey軟件分析獲知決明CHS基因中含有1個內含子和2個外顯子，其中內含子位置在188-765 bp之間，長度為578 bp（圖2）。

圖2 決明CHS基因外顯子內含子分析

內含子5'-端堿基為GT，3'-端堿基為AG，符合GU-AG剪切規律。外顯子1的位置在10-187 bp，長度為178 bp，編碼59個氨基酸和半胱氨酸的第一個堿基，外顯子2位于766-1 760 bp，編碼半胱氨酸的第2、3個堿基及331個氨基酸。在NCBI上利用CDD在線工具分析決明外顯子2編碼氨基酸序列的功能結構域，結果（圖3）顯示，外顯子2編碼氨基酸序列中包含了幾乎所有CHS的功能位點，包括活性位點、產物結合位點、丙二酰輔酶A結合位點和二聚體接口。

圖3 外顯子2保守結構域及活性位點分析

2.3.2 決明CHS的DNA內含子分析 通過DNAMAN分析獲知決明CHS內含子中含有多個酶切位點，其中VspⅠ酶切位點2個、SnaBⅠ酶切位點2個及HpaⅠ、PacⅠ、SspⅠ酶切位點各1個（圖4）。使用在線軟件PlantCARE分析獲知CHS基因的內含子中含有18個順式調控序列，包括光誘導反應模塊、增強子、水楊酸誘導反應元件和生理節奏控制表達元件等 （表2）。

圖4 決明CHS內含子序列及酶切位點

2.3.3 不同物種的CHS基因內含子比對分析 利用NCBI資源庫查訊到矮牽牛、百合、大豆、黃芩、金蕎、苦蕎、擬南芥、日本水稻、紫葉李和歐洲赤松等10種植物CHS基因全長序列。利用在線軟件Spidey進行分析，發現10種植物的CHS基因中均含2個外顯子和1個內含子。不同植物CHS基因內含子的位置極度保守，即位于第65位（以歐洲赤松Pinus sylvestris的PSCHS為標準）的半胱氨酸密碼子內第1和2位堿基之間。但是，不同植物CHS基因的內含子序列長度變化較大，其中擬南芥CHS基因的內含子最短，只有87 bp，而日本水稻CHS基因的內含子最長，有1 655 bp（表3），表明不同植物CHS基因的內含子具有多態性，推測這種差異是由于在進化過程中，不同植物存在多樣性的生活史與生活環境，導致CHS基因發生不同程度的基因重復-分歧。

根據不同植物的內含子序列，計算CHS基因的相似度，構建NJ系統進化樹，結果（圖5）發現進化樹Bootstrap值較低，除蓼科植物金蕎、苦蕎外，大部分科的植物處在不同分支上，這種差異的形成可能與植物的生活史、生活環境等因素的影響有關，因此很難用于不同植物的遺傳分化和分子進化研究。2.3.4 外顯子2編碼的氨基酸序列的系統進化樹構建及Bootstrap檢驗 分析不同植物CHS基因編碼的氨基酸序列，發現CHS基因中外顯子1較短，編碼約57-64個氨基酸，長度變化較大；外顯子2較長，編碼約340個氨基酸，沒有大的插入和（或）缺失突變。由于外顯子2的長度和序列上比前者要保守，因此進一步選擇外顯子2編碼氨基酸序列構建NJ系統進化樹。

表2 CHS內含子調控序列分析

表3 各物種間CHS基因內含子相似性

圖5 內含子序列系統發育分析

在用NJ法構建的外顯子2系統進化樹（圖6）大部分Bootstrap值>70，表明進化樹可靠性較高，從進化樹中發現金蕎與苦蕎等蓼科植物的進化關系更為接近，而大豆和決明等豆科植物進化關系更為接近，表明CHS外顯子2編碼的氨基酸序列是CHS中較為保守的部分，可作為生物遺傳分化和分子進化研究中的重要依據。

圖6 外顯子序列系統發育分析

3 討論與結論

雖然不同植物的CHS基因只有1個內含子，但其長度變化較大，具有明顯的多態性。構建不同植物CHS基因內含子序列的系統進化樹，結果發現大部分科的植物處在不同分支上，很難用來不同植物的遺傳分化和分子進化研究。相比較CHS基因外顯子1，外顯子2的長度和序列均更加保守，因此構建外顯子2編碼氨基酸序列的系統進化樹能夠較準確反映不同植物的親緣關系，可作為植物遺傳分化和分子進化研究的重要依據。

以決明子葉為材料，獲得了決明CHS基因的全長序列。該基因編碼區起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA，全長1 766 bp。決明CHS基因由1個內含子和2個外顯子組成，其中外顯子2比外顯子1的序列更趨于保守，編碼幾乎所有功能位點。決明CHS基因的內含子長度為578 bp，符合GU-AG剪切規律，含有VspⅠ、Sna BⅠ、HpaⅠ、PacⅠ和SspⅠ酶切位點，以及光誘導反應模塊、增強子、水楊酸誘導反應元件和生理節奏調控元件等18個順式調控元件，是內含子影響基因表達調控的有力結構依據，但其具體作用機制有待進一步研究。

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