采用正交設計法優化梨SSR-PCR體系

畢紅園 王長彪 段永紅 郭黃萍 孫毅，5

（1.山西大學生物工程學院，太原 030006；2.山西省農業科學院生物技術研究中心，太原 030031；3.山西農業大學農學院，太谷 030801；4.山西農科院果樹研究所，太谷 030815；5.農業部黃土高原作物基因資源與種質創制重點實驗室，太原 030031）

梨屬于薔薇科（Rosaceae），梨屬（Pyrus L.）植物［1］。全世界梨屬植物約有60種，我國是梨屬植物的起源中心，蘊藏著豐富的種質資源，原產我國的梨屬植物現有18個種，7個亞種，栽培品種約有3 000多個，栽培面積和總產量在國內主要水果中均排第3位［2］。目前，隨著我省農業產業結構的調整，出現了一批自有知識產權的梨樹新品種和新材料，但由于市場混亂，現有的新品種得不到有效的保護和鑒定，極大地損害了相關單位和個人的利益，同時也阻礙了我省農業經濟的大力發展。為此，進行梨樹品種間鑒定，保證品種的真實性和純度，維護生產者與育種者的利益就顯得尤為重要。近年來，迅速發展的DNA分子標記技術為優良品種的引進，品種快速準確的鑒定和偽劣苗木的早期識別提供了有效的手段。

已有學者選用不同的分子標記技術對梨開展了研究。其中，SSR標記（Simple Sequence Repeat）是一種新興的分子標記技術，可應用于遺傳圖譜的構建、基因定位、親緣關系分析和指紋圖譜構建等領域［3］。由于該標記分布于整個基因組，具有數量豐富，等位變異高，共顯性，檢測簡單，結果穩定可靠等優點［4］，在品種鑒定等方面已到了廣泛應用［5-10］。雖然已有對梨品種進行分子標記研究的報道，但尚未見報道關于梨SSR-PCR體系優化的研究，并且由于不同的梨品種所要求的體系并不完全相同，因而無法建立一個完整統一的模式。本次試驗采用正交設計L16（45）方法對梨SSR-PCR反應體系的5因素（Taq DNA 聚合酶、Mg2+、模板DNA、dNTPs、引物的濃度）在4水平上進行優化，并對結果用DPS數據處理軟件進行較為詳細地分析，又用梨的24個品種對此體系進行檢測，以期建立一個較為完整可靠的梨屬SSR-PCR反應體系，為梨品種鑒定和新品種保護提供依分子生物學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

“碩豐梨”品質優良、抗寒性較強，在我省冷涼地區有較大的種植面積，因而本試驗采用“碩豐梨”作為試材。該品種葉片取自山西省農科院果樹研究所，采回后置于-70℃冰箱備用。引物參照NCBI網站中梨屬的EST序列，經MISA軟件分析，并用Primer3軟件設計獲得梨屬SSR標記引物，該引物由上海生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取及濃度純度檢測 梨樹總DNA提取采用改良的CTAB法［11］，在核酸蛋白檢測儀（SXABRC，eppendorf-Bio-photometer）上 測 定DNA樣本的濃度及純度。用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質量。將DNA樣品置于-20℃下保存備用。

表1 PCR反應的因素和水平

表2 PCR反應因素水平L16 （45 ）正交試驗設計

1.2.2 PCR反應因素水平的確定與正交表的設計 在PCR反應中，Taq 聚合酶、Mg2+、dNTP、引物、DNA模板是影響反應的5個主要因素。為確定它們在PCR反應中的最佳水平，針對這5個因素，每個因素設4個水平，見表1，采用正交設計L16（45）進行試驗［12，13］。設計方案見表2，設3次重復，共48個PCR管，按表中的數據加樣；另外每管還加入1 μL的10×PCR Buffer（終濃度為1×PCR Buffer），其余用ddH2O補足，反應體系總體積為10 μL。

1.2.3 PCR擴增及其產物的檢測 PCR擴增反應在東勝創新生物科技有限公司的EDC-810型基因擴增儀上進行。反應程序為：94℃預變性3 min ；94℃變性1 min，57℃退火45 s，72℃延伸1 min，35個循環；72℃延伸10 min，4℃保存。以上海生物工程有限公司的Marker為對照，用6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，在北京六一儀器廠DYCZ-30C型電泳儀上于300 V恒壓下電泳40 min，拆板后觀測并拍照分析。參照劉明珍、何正文等［14］的方法，依擴增條帶的敏感性和特異性進行計分，分數越高，表示擴增帶的敏感性、特異性越好。

1.2.4 最佳反應體系的驗證 從梨屬的SSR引物中，隨機選擇1對引物，對梨屬24個品種的DNA進行擴增，以驗證優化的梨屬SSR-PCR反應的穩定性。

2 結果

2.1 DNA質量檢測

SSR標記雖然對DNA的質量要求不高，但如果DNA樣品不純則會影響PCR反應，使試驗結果不穩定。本試驗采用改良的CTAB法提取梨屬DNA，所提DNA無色透明，可溶性好。用核酸檢測儀檢測DNA溶液純度和濃度，經瓊脂糖凝膠電泳（0.8%）檢測DNA的質量，觀察到條帶清晰且無降解，說明提取的DNA質量高，完整性好，可用于SSR分析（圖1）。

圖1 24個梨品種的DNA電泳圖

2.2 PCR擴增結果直觀分析

2.2.1 梨SSR反應體系的優化設計及擴增結果 按照表2正交設計的16個處理組合，進行PCR反應和電泳檢測，結果見圖2。結果表明，5種反應因素濃度組合不同，其擴增的效果也不一。唯一相同的是16個處理組合都沒有擴增出分子量小于100 bp的引物二聚體。其中2、8、14號處理組合擴增效果較差，條帶不清晰且不易觀察；6、15、16號處理組合擴增的條帶目的條帶多且容易觀察。根據圖片，結合遺傳多樣性分析的要求，將16個處理組合分別進行打分，即將條帶數量豐富、清晰度高、背景低的擴增產物記為16分，而最差的記為1分。由圖中1-16處理組合可知，條帶數量最豐富且清晰的是6號處理組合，賦值為16，幾乎無條帶的13號處理賦值為1。按此方法對16個處理組合分別計分為4、3、12、13、10、16、5、2、6、7、8、9、1、11、15、14，并對不同因素與水平的電泳評分平均值和極差進行計算分析，結果如表3所示。

圖2 正交體系凝膠電泳圖

極差R值的大小表明各因素影響程度的高低，R越大，說明該因素對結果影響越大。因此，該體系中對結果影響的大小順序是引物、Mg2+、dNTP、DNA模板、Taq聚合酶。其中，每一因素各水平均值大小K，反映了各因素不同水平對反應體系的影響情況，均值越大說明反應水平越好。

表3 正交設計直觀分析

2.2.2 各因素濃度對梨PCR反應結果的影響 由表3可看出，Taq DNA聚合酶濃度處理組合中平均分數最低的是水平3，即Taq DNA聚合酶濃度為1.0 U時平均分值僅為7.500分；而平均分數最高的是水平4，即Taq DNA聚合酶濃度為1.4 U時平均分值最高為10.250分，說明1.4 U Taq DNA聚合酶濃度為梨PCR反應的適宜濃度。Mg2+處理組合中平均分數最低的是水平1，即Mg2+濃度為1.0 mmol/L 時平均分值為5.250分；而分數最高的是水平3，即Mg2+濃度為2.0 mmol/L 時平均分值最高為10.00分，說明2.0 mmol/L Mg2+濃度為梨PCR反應的適宜濃度。同理可得出dNTP最優濃度為0.1 mmol/L、引物最優濃度為0.5 μmol/L、DNA模板最優濃度為50 ng。

2.3 最佳反應體系穩定性檢測

應用上述正交試驗所獲得的最佳反應體系，用1對引物對梨屬24個品種的DNA進行擴增，結果如圖3顯示，每份DNA樣品均能擴增出清晰的目的條帶。說明該體系比較穩定，適用于梨屬植物遺傳多樣性的SSR標記研究。

圖3 最佳體系的24個梨品種電泳圖

3 討論

為了對梨進行遺傳多樣性研究，需要獲得高質量的DNA。而梨的葉片中也存在大量的糖、酚類等物質，因而用傳統的CTAB法所提取的梨DNA質量效果不太好，改良后的CTAB法可將細胞中的多糖，多酚去除，效果較好。

SSR分子標記技術以其便捷可操作性高，重復性高等優點，近年來在植物的種質鑒定、遺傳多樣性檢測、親緣關系分析和遺傳圖譜構建等方面得到廣泛應用。但SSR-PCR 反應體系同樣受到dNTPs、Taq DNA聚合酶、引物、DNA模板用量等因素的影響，例如，模板濃度過低會導致結果不穩定及條帶模糊；濃度過高時引物與dNTPs過早耗盡，結果也不穩定。引物濃度偏高會引起堿基錯配和非特異性產物的產生，形成引物二聚體。而Taq酶的濃度過高不僅增加試驗成本，而且極易產生非特異性擴增產物；濃度過低則會導致產物的合成效率下降［15］。同時，Taq DNA聚合酶是Mg2+依賴性酶，對Mg2+濃度非常敏感。并且dNTP分子中的磷酸基團能定量地與Mg2+結合，使游離的Mg2+濃度降低［16］。因而確定其最優體系，對PCR反應是否成功、所得的結果是否準確，以及PCR的擴增效率都有重要的影響［17］。

傳統的單因素試驗篩選反應體系，需要進行多次的梯度試驗，試驗繁瑣［18］，但是正交試驗因在減少試驗規模的同時又不損失信息，能更加快速找到最優組合［19］，同時也可借助于數學上的統計分析方法對試驗結果進行分析與處理，獲得可靠的結論，使分析結果更科學、完善和簡便。不過不能忽視的是該方法也有不足，對照圖片進行打分法，存在一定的主觀性，因而也需要有進一步的改進。

4 結論

最終確立梨SSR-PCR最佳的反應體系（10 μL）為：1.0 μL 10×PCR Buffer、Taq DNA聚合酶1.4 U、Mg2+2.0 mmol/L、DNA模板50 ng、dNTPs 0.1 mmol/L、引物0.5 μmol/L。擴增程序：94℃預變性3 min ；94℃變性1 min，57℃退火45 s，72℃延伸1 min，35個循環；72℃延伸10 min，4℃保存。用此反應體系和擴增程序在24份梨品種材料中獲得的結果清晰穩定，重復性好。因而初步確定此反應體系可用于梨屬植物的PCR擴增分析。

［1］ 胡芳名, 譚曉風, 劉惠民.中國主要經濟樹種栽培與利用［M］.北京：中國林業出版社, 2006：402-407.

［2］ 甘玲, 湯浩茹, 董曉莉. 梨種類和品種鑒定研究進展［J］.中國農學通報, 2006, 22（5）：302-306.

［3］ 鄒喻萍, 葛頌, 王曉東.系統與進化植物學中的分子標記［M］.北京：科學出版社, 2000：103-107.

［4］ McCouch SR, Temnykh S, Lukashova A, et al. Microsatellite markers in rice：abundance, diversity, and applications［M］. Rice GeneticsⅣ, 2001：117-135.

［5］ 韓國輝, 向素瓊, 汪衛星, 等. 沙田柚雜交后代群體的SSR鑒定與遺傳多樣性分析［J］.中國農業科學, 2010, 43（22）：4678-4686.

［6］ 高華, 樊紅科, 萬怡震, 等. 蘋果栽培品種的SSR鑒定及遺傳多樣性分析［J］. 西北農業學報, 2011, 20（2）：153-158.

［7］ 陳琛, 張興桃, 程斐, 等. 秋甘藍品種的SSR指紋圖譜的構建［J］. 園藝學報, 2011, 38（1）：159-164.

［8］ 王省芬, 馬峙英, 潘玉欣, 等. 轉基因抗蟲棉SSR和AFLP遺傳變異研究［J］. 植物遺傳資源學報, 2006, 7（2）：153-158.

［9］ 吳渝生, 楊文鵬, 鄭用璉. 3個玉米雜交種和親本SSR指紋圖譜的構建［J］. 作物學報, 2003, 29（4）：496-500.

［10］ 韓宏偉, 楊敏生, 徐興興, 等. 利用SSR標記鑒定主要梨栽培品種［J］. 中國農學通報, 2006, 22（12） 496-500.

［11］ 曹麗, 曲柏宏, 王成. 一種新的梨基因組DNA提取方法及其應用［J］. 湖北農業科學, 2006, 45（3）：23-25.

［12］ 袁志發, 周靜芋. 試驗設計與分析［M］. 北京：高等教育出版社, 2000：467.

［13］ 唐啟義, 馮明光.實用統計分析及其DPS 數據處理系統［M］.北京：科學出版社, 2001.

［14］ 何正文, 劉運生, 陳立華, 等.正交設計直觀分析優化PCR條件［J］.湖南醫科大學學報, 1998, 23（4）：403-404.

［15］ 沈鵬, 董麗. 大苞萱草ISSR-PCR反應體系的建立與優化［J］. 生物技術通報, 2010（9）：129-133.

［16］ 張瑞麗, 許玉蘭, 王大瑋, 等.云南松SSR-PCR反應體系的建立與優化［J］.生物技術通報, 2012（4）：93-97.

［17］ 劉天亮, 潘東明, 許長同, 等. 橄欖ISSR-PCR反應體系的優化［J］.生物技術通報, 2010（7）：137-141.

［18］ 王士磊, 李玉鵬, 高樹仁. 正交設計優化玉米SSR-PCR反應體系的研究［J］. 基因組學與應用生物學, 2009, 28（1）：119-122.

［19］ 續九如, 黃智慧. 林業試驗設計［M］. 北京：中國林業出版社, 1998：65-79.