基因組重排選育Epothilone B高產菌株

王大紅 劉飛

（1.河南科技大學食品與生物工程學院，洛陽 471023；2.南陽師范學院生命科學與技術學院，南陽 473061）

Epothilone B是由德國生物技術研究中心首次從纖維堆囊菌分離得到的十六元大環內酯類化合物［1］，該物質能促進微管蛋白聚合，水溶性好，其活性是紫杉醇的2 000-3 000倍［2-4］。目前，美國、瑞士等國開始從事相關研究，而我國主要是山東大學、華南理工等機構做了一些相關研究。2007年由美國施貴寶公司開發的Epothilone B內酰胺衍生物Ixabepilone獲得FDA批準在美國上市，這是第一個上市的Epothilones衍生物，每毫克大約70美元［5］。目前纖維堆囊菌So.ce 90菌的產量低，雖然在發酵過程中通過補料方式或不斷更新吸附樹脂可以提高Epothilones類似物的產量，但是毫克級的產量給Epothilones的開發及應用帶來了很大困難［6］。因此，菌種的篩選、選育及發酵條件的探索仍然是Epothilone B研究者需要研究的重點目標之一。

基因組重排（genome shuffling）是一種基于原生質體融合，并對原生質進行遞推式融合的新型體內分子育種方法。2002年，Zhang等［7］首次系統地提出了基因組重排的概念并成功地將該技術運用于快速提高弗氏鏈霉菌合成泰樂菌素的能力。隨后，Gendy等［8］采用基因組重排技術選育綾霉素的產生菌Nocardia sp. ALAA 2000，選育后綾霉素比起始菌株提高了19倍。Xu等［9］利用該技術使Trichoderma viride產纖維素酶的能力提高了1.97倍。隨著基因組重排技術的不斷發展和成熟，通過基因組重排提高代謝產物產量的例子不斷出現，表明該項技術作為新代謝產物開發的途徑具有一定的應用前景。本研究旨在采用基因組重排技術改良Epothilone B產生菌，選育出高產Epothilone B的優良變異菌株，研究結果具有一定的理論和實際意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 親本菌株SC4-14和SC4-56是由纖維堆囊菌AHB125（S. cellulosum AHB125）經過紫外誘變和2%乙酸鈉抗性篩選出來并保存的Epothilone B高產菌株［10］。

1.1.2 培養基和溶液 斜面培養基、種子培養基和發酵培養基參見參考文獻［10］。

再生固體培養基（g/L）：蔗糖171.5，MgCl24.273，酪胨3.0，酵母浸膏1.0，CaCl21.0，瓊脂粉16.0，pH7.2-7.4。

HEPES緩 沖 液：HEPES 20 mmol/L，MgCl220 mmol/L，蔗糖0.5 mol/L，pH6.8，滅菌備用。

溶菌酶溶液：稱取0.1 g溶菌酶，加入HEPES緩沖液溶解并定容至10 mL，過濾除菌，4℃保存，使用時稀釋。

35% PEG4000溶液（W/V）：PEG4000定容于100 mL HEPES緩沖液。

1.2 方法

1.2.1 Epothilone B的發酵與測定 Epothilone B的發酵與測定見參考文獻［10］。Epothilone B的測定采用HPLC法，通過Epothilone B的保留時間和光吸收曲線對基因組重排后的高產菌株發酵產物中的Epothilone B進行定性。

1.2.2 原生質體的制備及再生 菌體培養至對數生長期（48 h）時，加入終濃度為0.01 mol/L EDTA和1%甘氨酸，繼續培養4 h，取一定量培養好的菌液，1 000 r/min離心5 min，取上清液5 000 r/min再離心10 min并收集菌體，HEPES緩沖液洗滌2次，將菌體保存在5 mL HEPES緩沖液中。然后加入溶菌酶液并混勻，使其終濃度為5 mg/mL，37℃水浴保溫酶解破壁1 h，定時鏡檢。酶解后，3 000 r/min離心10 min并收集原生質體，用等體積的HEPES液重懸，振蕩混勻，離心棄上清，再用HEPES液洗滌1次，等體積重懸，與冷卻至45℃左右的上層再生固體培養基混勻，傾入已孵育過夜的再生固體培養基上，30℃培養5-7 d，觀察再生情況。

1.2.3 原生質體的滅活 紫外線滅活：將原生質體溶液移入無菌培養皿中，置于已預熱穩定的15 W紫外燈下，垂直距離為30 cm，分別照射60、70、80、90、100、110和120 s進行滅活，經HEPES緩沖液10倍系列稀釋后，涂布于再生平板上，30℃避光培養5-7 d，檢查滅活效果。

熱滅活：將原生質體溶液置于無菌離心管中，置于溫度分別為55、60、65和70℃水浴鍋中，保溫10、15、20、25和30 min進行滅活，經HEPES緩沖液10倍系列稀釋后，涂布于再生平板上，30℃避光培養5-7 d后，觀察結果，檢查滅活效果。

1.2.4 基因組重排 對親本株SC4-14的原生質體進行熱滅活，對親本株SC4-56的原生質體進行紫外滅活，將滅活的原生質體用35% PEG4000（含0.02 mol/L CaCl2）在37℃條件下隨機融合20 min。然后用5倍體積的HEPES緩沖液稀釋，并3 000 r/min離心5 min，收集原生質體后稀釋并涂布于再生培養基上再生，30℃培養3-7 d，全部再生菌落即為F1代融合菌群；將生長旺盛的融合子菌落轉接到液體培養基中，培養24 h，檢測發酵液中Epothilone B的含量，產量提高的突變株為第1輪融合株F1，再將產量較高的優良菌株（F1）進行下一輪原生質體制備、滅活、融合與篩選，所得突變株即F2。如此反復進行4 輪循環原生質體融合、再生，不同融合子代標記為F1、F2、F3和F4，同時以原始菌株做對照。

1.2.5 突變菌株遺傳穩定性的測定 將生產能力較高的幾株菌接種至固體培養基中傳代10次并進行發酵試驗，檢測Epothilone B的含量，選擇遺傳穩定性較好、產量穩定的重組菌株作為高產重組菌株。

1.2.6 發酵過程曲線的測定 將親本菌株與基因重排后的菌株種子液以10%接種量接種于發酵培養基，分別于發酵的第1、2、3、4、5、6、7和8天取樣，分別測定其菌體生長曲線和EpothiloneB含量，繪制其發酵過程曲線。其中生長曲線采用分光光度計測定在OD600下的吸光值，EpothiloneB含量測定采用HPLC法。

2 結果

2.1 原生質體的制備和再生

在試驗過程中需要對原生質體制備的影響條件進行考察。經過前期的研究確定溶菌酶最終質量濃度為4 mg/mL、酶解溫度為37℃、酶解時間為60 min，在此條件下原生質體的形成率和再生率最高。

2.2 原生質體滅活

2.2.1 熱滅活原生質體 從表1 可見，當菌株SC4-14原生質體在70℃恒溫水浴中處理20 min 時，原生質體致死率達到100%。但當溫度超過65℃時，原生質體容易黏結成團，不利于原生質體的融合。因此，本試驗確定60℃、處理25 min 作為Epothilone B產生菌原生質體熱滅活的條件。

表1 熱滅活時間和溫度對SC4-14原生質體致死率的影響

2.2.2 紫外線滅活原生質體 從圖1可以看出，當紫外線照射SC4-56的原生質體時間為110 s 時，原生質體致死率為100%。因此，選用紫外線照射110 s 作為Epothilone B產生菌原生質體紫外滅活的處理時間。

圖1 紫外線滅活時間對SC4-56原生質體致死率的影響

2.3 基因組重排

為獲得更多重排的正突變基因組合，選用兩個親株SC4-14和SC4-56作為基因重排的出發親本，這2個親本是由S. cellulosum AHB125經過紫外誘變和2%乙酸鈉抗性篩選而獲得的。經過4輪基因組重排試驗后，獲得62株生長速度較快的菌株，對得到的重排菌株進行產量測定，得到8株產量相對較高的重組菌株。從圖2中可以看出，原始菌株S. cellulosum AHB125 Epothilone B的產量為8.2 mg/L，制備原生質體的兩株親本菌株SC4-14和SC4-56的Epothilone B產量分別為13.6 mg/L和14.5 mg/L。獲得的8株高產菌株其Epothilone B的產量都是SC4-14和SC4-56菌株的2倍以上，并且菌落形態和顏色與起始菌株相比沒有發生明顯變化。其中F4-13（58.8 mg/L） 和F4-28（67.4 mg/L）的產量最高，Epothilone B的產量是SC4-14菌株產量的4.3倍和5.0倍，是SC4-56菌株產量的4.1倍和4.6倍，是原始菌株纖維堆囊菌AHB125 Epothilone B產量的8倍。

圖2 基因組重排篩選結果

2.4 遺傳穩定性試驗

將篩選出的8株高產菌株連續傳代10次后，進行搖瓶發酵試驗，以搖瓶的產量作為篩選的指標，結果（表2）顯示，傳代后的菌株發酵產量沒有明顯下降，表明篩選到的重排菌株的高產性狀遺傳特性較穩定。F4-6、F4-45和 F4-56的產量有明顯下降，其遺傳穩定性差；而其它5株的遺傳性穩定性較好，其中F4-28的產量最高，Epothilone B的產量一直穩定在67 mg/L左右。

表2 重組菌株的Epothilone B產量（mg/L）

2.5 菌株SC4-56和F4-28在10 L發酵罐中的發酵過程比較

將親本菌株之一SC4-56和重排菌株F4-28在10 L發酵罐上分別進行發酵試驗，其發酵過程曲線如圖3所示。兩種菌株在發酵過程中的生長曲線大致相似，都在第3天達到菌體的最大值，但重排菌株F4-28的細胞密度要大于親本菌株，并提前進入衰亡期。在Epothilone B積累過程中，兩者在發酵罐中的產量都比在搖瓶中要高約10%，SC4-56在第6天產物達到最大值（18.5 mg/L），而F4-28在發酵的第5天達到最大值（75.2 mg/L），比親本菌株的發酵周期要短1 d。因此，重排菌株F4-28在發酵生產上更易于提高發酵罐的利用效率。

圖3 SC4-56和F4-28在10 L發酵罐中的發酵過程曲線

3 討論

采用物理、化學方法來提高Epothilone B產量的傳統誘變育種方法存在誘變效率低、篩選工作量大、周期長、重復誘變過程造成一些無關的或負向突變的積累等缺點，很難大幅度提高Epothilone B產量；而由于黏細菌的特殊性，通過基因工程提高Epothilone B的方法很少被研究［11］。基因組重排技術是一種多親本遞歸式原生質體融合技術，親本菌株在全基因組的不同位置上同時發生重組，發生多交換和多基因重組，最終使不同的正向基因重組到同一個細胞株中，因此相對容易大幅度提高目的產物的產量，是改善工業微生物表型的直接而有效的方法［12］。另外，尤其適用于微生物的代謝途徑、編碼生物合成酶的基因以及基因表達調控的機制不清楚的代謝產物。與傳統的理化誘變方法相比，基因組重排技術可更快速、高效地篩選出表型優良的菌株，且在篩選庫的建立過程中剔除了負突變，彌補了經典誘變方法負突變的缺陷［13］。

本研究中采用熱滅活和紫外滅活兩種方式處理原生質體，然后再融合，這樣避免了同種滅活方式造成的相同部位發生損傷的缺陷，使不同菌株間染色體不同部位的致死損傷可以得到互補，從而提高了重組的效率。本研究首次嘗試采用基因組重排技術改良纖維堆囊菌AHB125，獲得一株遺傳性能穩定的高產菌株F4-28，Epothilone B的產量達到了67.4 mg/L，是原始菌株纖維堆囊菌AHB125的8倍，是兩親本菌株SC4-14和SC4-56的5倍。因此，采用基因組重排技術是一種有效的提高Epothilone B產量的方法。雖然本研究取得了很大的進步，但是Epothilone B的產量與目前已報道菌株S. cellulosum So0157-2的產量（104 mg/L）相比還有較大差距［14］。這主要是因為本研究所用的菌株來源與其不同，纖維堆囊菌AHB125是由本實驗室研究人員從自然界中分離并鑒定的，其初始產量很低，并且前期的菌種選育研究的較少，而S. cellulosum So0157-2已經過多次誘變。因此，在下一步的工作中，應該把基因組重排與其它誘變育種技術聯合使用，Epothilone B的產量可能會更高。同時，本研究也再次證明了基因重排技術在菌種選育中的有效性及高效性，同時為應用該技術選育高產Epothilone B菌株和研究Epothilone B的代謝調節奠定了基礎。

4 結論

采用基因組重排的方法對Epothilone B產生菌纖維堆囊菌SC4-14和SC4-56進行菌株選育，獲得5株目標物質產量較高并且遺傳性能穩定的變異菌株，其中最優菌株F4-28的Epothilone B產量達到了67.4 mg/L，是兩親本菌株SC4-14和SC4-56的5倍，通過比較該菌株與親本菌株之一SC4-56的發酵過程，F4-28的Epothilone B產量在第5天達到最大值，比SC4-56的發酵周期少1 d，可以縮短發酵周期。

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