青貯飼料中優良乳酸菌的分離鑒定及其生物學特性研究

何軼群 雷趙民 吳潤 萬學瑞 刁小龍 艾文娜

（1.甘肅農業大學動物醫學院，蘭州 730070；2.甘肅農業大學動物科學技術學院，蘭州 730070）

近幾年來，我國畜牧業發展迅速，動物養殖規模日益擴大，但由于我國耕地面積減少，用于生產飼料的原料嚴重不足，加之對秸稈類植物的利用率相對較低，養殖業和飼料生產的矛盾日益突出，這些問題嚴重制約著我國畜牧業的發展。因此，發展飼料工業以及加大對秸稈類植物飼料化的轉化是目前我國畜牧業迫切需要解決的問題。目前對秸稈類粗飼料的加工處理主要有物理加工法、化學加工法和微生物發酵法，其中以微生物發酵法中的青貯法應用最為廣泛。這是因為秸稈類植物經微生物青貯發酵后具有柔軟多汁、氣味芳香、適口性好、原料營養保留較多、胡蘿卜素和蛋白質損失少、水分多以及可長期保存等特點［1-3］。研究發現，青貯飼料質量的好壞又同它所含有的乳酸菌有很大的關系，但秸稈類植物表面附生的乳酸菌數往往較少，為改善青貯飼料的營養品質，最行之有效的方法是添加優質乳酸菌生物添加劑，使乳酸菌迅速成為青貯環境的優勢菌群，迅速降低青貯飼料的pH值，抑制有害菌的生長，改善青貯飼料發酵品質、抑制二次發酵，從而達到長期保存飼料營養物質的目的。并且乳酸菌是動物胃腸道的益生菌群，代謝產生的有機酸、細菌素、過氧化氫、雙乙酰等多種天然抑菌物質，具有維持腸道內菌群平衡，提高機體免疫力，促進營養物質吸收等多種功能［4］。

青貯飼料中含有豐富的乳酸菌，包括腸球菌、乳酸乳球菌、明串珠菌、鏈球菌和乳桿菌等，它們在青貯飼料發酵中起重要作用。本試驗旨在從青貯飼料中分離生物學特性優良的乳酸菌，從而為青貯飼料添加劑的研究和應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 青貯樣品 玉米秸稈青貯飼料樣品采自甘肅省平涼、臨洮、康樂等地青貯窯。樣品采集后迅速置于無菌自封袋中，4℃保存。

1.1.2 菌株及主要試劑 參考菌株：干酪乳桿菌（Lactobaillus casei）、乳酸乳球菌乳酸亞種（Lactocaccus lactis subsp. lactis）均由甘肅農業大學食品科學與工程學院甘伯中教授惠贈；大腸桿菌（Escherichia coli）、沙門菌（Salmonella）、蠟狀芽胞桿菌（Bacillus cereus）、金黃色葡萄球菌（Streptococcus aureus）、酵母菌（Saccharomycetes）、青霉菌（Penicillium）、曲霉菌（Aspergillus）、根霉菌（Rhizopus）、E. coli DH5α均由本實驗室保存；細菌基因組提取試劑盒購自北京百泰克生物技術有限公司；糖微量發酵管購自青島海博生物科技有限公司；其它所需試劑均為進口或國產分析純產品。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離

1.2.1.1 樣品采集處理 樣品經四分法處理后，無菌稱取25 g加入225 mL滅菌生理鹽水中，于37℃恒溫搖床搖動2 h備用。

1.2.1.2 乳酸菌的分離 用無菌生理鹽水稀釋樣品溶液，取10-3-10-5三個稀釋度，各稀釋度取液體0.1 mL分別均勻涂布于含有CaCO3的MRS和M17培養基平板上，將平板置于厭氧培養盒后37℃培養72 h。

1.2.2 乳酸菌分離株的鑒定

1.2.2.1 乳酸菌分離株的初步鑒定 挑取溶鈣圈較明顯的典型菌落，在MRS平板上反復劃線得到單個菌落，觀察記錄菌落形態，進行革蘭氏染色鏡檢，并做觸酶試驗。

1.2.2.2 乳酸菌生理生化鑒定 根據文獻［5］中的方法，對疑似乳酸桿菌做運動性、明膠液化、吲哚、H2S產生、硝酸鹽還原和pH4.5生長試驗。對于疑似乳酸球菌還需要做精氨酸分解、葡萄糖產酸產氣、10℃和45℃生長、pH9.6生長和6.5% NaCl生長試驗。對所有菌株采用糖微量發酵管法進行糖發酵試驗。

1.2.2.3 乳酸菌16S rRNA基因序列分析 參考已發表的乳酸菌通用引物進行細菌16S rRNA基因擴增，正向引物5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'［6］；反向 引 物5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'［7］。以 上引物由上海Invitrogen公司合成。細菌基因組DNA的提取嚴格按照試劑盒說明進行。PCR擴增體系為25 μL，上下游引物各1 μL、模板DNA 2 μL、預混酶12.5 μL、水8.5 μL。反應條件：95℃預變性5 min；95℃ 45 s，50℃ 45 s，72℃ 1.5 min，35個循環；72℃延伸10 min，4℃保存。預計擴增片段長度約為1 500 bp。將PCR產物回收后，連接pMD18-T載體并轉化E. coli DH5α，經藍白斑篩選為陽性克隆后送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。將測序結果在GenBank中進行BLAST分析。

1.2.3 優良乳酸菌的篩選

1.2.3.1 產酸性試驗 將活化的乳酸菌分離株按5%量接入MRS液體培養基，每組設3個重復，置于37℃恒溫培養箱培養30 h，每隔2 h無菌取樣測pH值，記錄結果。

1.2.3.2 抑菌試驗 乳酸菌分離株發酵上清液抑菌試驗參照文獻［8］進行。

1.2.4 乳酸菌生物學特性測定

1.2.4.1 乳酸菌生長曲線的測定 將活化的乳酸菌按5%量接入MRS液體培養基，37℃恒溫培養30 h。每隔2 h取樣測各組菌液的OD600nm值，繪制生長曲線圖。

1.2.4.2 溫度敏感試驗 將活化的乳酸菌按5%量接入MRS液體培養基后分別置于37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃溫箱，每組設3個重復，恒溫培養15 h，取樣測各組菌液的OD600nm值，以培養溫度為橫坐標，菌液OD600nm值為縱坐標制圖。

1.2.4.3 耐鹽性試驗 將活化的乳酸菌按5%量分別接入NaCl濃度為（0、0.02、0.04、0.06、0.08和1.0 g/mL）的MRS液體培養基中，每組設3個重復，37℃恒溫培養15 h，取樣測各組菌液的OD600nm值，以Na-Cl濃度值為橫坐標，菌液OD600nm值為縱坐標制圖。

1.2.4.4 不同pH值生長試驗 將活化的乳酸菌按5%量分別接入pH為2、4、6、8和10的MRS液體培養基中，每組設3個重復，37℃恒溫培養15 h，取樣測各組菌液的OD600nm值，以pH值為橫坐標，菌液的OD600nm值為縱坐標制圖。

2 結果

2.1 乳酸菌分離

從含有CaCO3的MRS和M17平板上挑取溶鈣圈直徑>4 mm的菌落，在MRS平板上純化后保存。

2.2 乳酸菌分離株鑒定

2.2.1 形態、染色及培養特性 在MRS培養基上出現乳白色或灰白色、表面光滑、邊緣整齊、大小不一的圓形菌落，經革蘭氏染色為陽性、無芽孢、觸酶試驗陰性的初步鑒定為乳酸菌，共分離出12株細菌。

2.2.2 乳酸菌生理生化特性 參考菌株的各生理生化試驗均與標準相符，依據分離株的生理生化特性（表1-表3），結合形態和染色特征，12株乳酸菌分離株的運動性、明膠液化、吲哚形成、H2S試驗、硝酸鹽還原試驗均為陰性，其中B1-4、B2-7、B2-8、B2-9、B3-1的pH4.5生長試驗為陽性，被鑒定為乳桿菌屬細菌，除B1-4外上述各菌株在糖發酵類型上與植物乳桿菌非常相似可能為相同的種。B1-7不分解精氨酸，45℃、6.5% NaCl、pH9.6生長試驗均為陰性，被鑒定為明串珠菌屬，B1-3、B1-6、B2-3、B4-5、B5-1、B5-2的各生理生化試驗結果非常相似，但B1-3、B1-6、B2-3、B4-5、B5-1在糖發酵類型上更為相似，通過生理生化試驗暫不能將以上菌株鑒定到屬。B2-7、B2-8、B2-9、B3-1、B1-3、B2-3、B4-5、B5-1、B5-2利用葡萄糖只產酸不產氣，為同質型發酵乳酸菌，B1-4、B1-6、B1-7利用葡萄糖產酸產氣，為異質型發酵乳酸菌。

表1 乳酸桿菌生理生化特性

表2 乳酸球菌生理生化特性

表3 乳酸菌糖發酵結果

2.2.3 16S rRNA基因序列特征 PCR擴增產物經12 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測，12株分離乳酸菌在1 500 bp處出現特異性條帶，與預期擴增大小一致說明擴增成功。將各菌株的16S rRNA基因測序結果在GenBank中進行BLAST分析，各菌株與參考菌株的同源性均達到99%（表4）。菌株B1-3、B1-6、B2-3、B4-5、B5-1被鑒定為戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）、B2-7、B2-8、B2-9、B3-1被鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、B1-4被鑒定為發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）、B1-7被鑒定為腸系膜明串珠菌腸膜亞種（Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides）、B5-2被鑒定為屎腸球菌（Enterococcus faecium）。

表4 分離菌株16S rRNA序列的 BLAST分析結果

2.3 優良乳酸菌的篩選

表5 乳酸菌分離株的產酸性（pH值）

2.3.1 產酸性試驗 由表5可見，菌株B2-8產酸最快，接種4 h后pH降4以下，20 h后降到2.5；菌株B3-1、B1-6、B1-3次之，分別于6 h后降到4以下，20 h后降到3.0；菌株B2-9、B4-5接種8 h后pH下降到4以下，20 h后下降到3.0。以上菌株顯示了較好的產酸能力，具有良好的青貯潛力。菌株B1-7、B2-3、B2-7、B4-5、B5-1、B5-2產酸相對較慢，但20 h后降到4以下，也具有青貯潛能。

2.3.2 抑菌試驗 抑菌試驗結果由表6可以看出，所有測試乳酸菌分離株上清液對霉菌均無抑制作用，其中菌株B3-1抑菌譜寬，抑菌活性最佳，菌株B2-3和B2-8次之。B1-4、B2-9、B4-5、B5-2對病原細菌、霉菌、酵母菌均無抑制作用。

表6 乳酸菌分離株上清液的抑菌效果（mm）

通過產酸性試驗和抑菌試驗結果，再結合考慮青貯體系生物多樣性和菌種自身特性，初步篩選出B1-6、B1-7、B2-3、B2-8、B3-1和B5-2共6株優良的乳酸菌，并進一步對其生物學特性進行比較。

2.4 優良乳酸菌生物學特性比較

2.4.1 生長曲線測定 由圖1可知，菌株B1-7和B5-2適應期較短，在2 h后就進入對數期，生長速度較快，8 h后達到穩定期。其余各菌株的適應期較長，4 h后進入對數期，14 h后進入穩定期。

圖1 乳酸菌分離株的生長曲線

2.4.2 溫度敏感試驗 由圖2可知各菌株在培養溫度高于55℃時基本不再生長。B3-1、B2-8、B1-6和B2-3在培養溫度為50℃時OD值均較初始值高，說明上述菌株具有較強的耐高溫能力，B5-2次之。菌株B1-7對溫度較為敏感在培養溫度為45℃時基本不再生長。

圖2 乳酸菌分離株經不同溫度培養15 h后的OD600nm值

2.4.3 耐鹽性試驗 由圖3可知，隨著NaCl濃度的增高各菌株的生長也相應的減弱。B1-7和B5-2在NaCl濃度為0.08 g/mL時基本不再生長，其余菌株在NaCl濃度為0.1 g/mL時基本不再生長。B2-3在NaCl濃度為0.08 g/mL時較初始值顯著增高，說明其具有較強的耐鹽能力。

2.4.4 不同pH值生長試驗 由圖4可知培養基pH過高或過低均不利于菌株的生長。各菌株在培養基pH為6時OD值最大，說明pH6為各菌株的最佳培養條件。B3-1、B2-8、B1-6、B2-3和B5-2在pH為4、8、10時OD值均較初始值高說明有較強的耐酸堿能力，但B1-7在pH為10時基本不再生長。

圖3 乳酸菌分離株在不同NaCl含量培養基中培養15 h后的OD600nm值

圖4 乳酸菌分離株在不同pH培養基中培養15 h后的OD600nm值

3 討論

秸稈類植物青貯過程中，其表面帶有的乳酸菌起到不可替代的作用，在青貯飼料中可能存在優良的青貯用乳酸菌，且由于其附生于植物表面，更能適應青貯環境。因此，從青貯飼料中分離篩選青貯用優良乳酸菌是一條高效、快速的方法。對分離的細菌在形態特征、培養特征和生理生化特征的基礎上，結合16S rRNA基因核苷酸序列分析方法，從基因水平對其鑒定是目前較常用的一種方法［9，10］。本研究首先通過傳統鑒定方法將細菌鑒定到屬，部分細菌還可鑒定到種，最后通過16S rRNA基因序列分析法對上述鑒定結果進行驗證進一步說明了生化鑒定的準確性，提高了細菌鑒定的準確率。

青貯時乳酸菌通過厭氧呼吸將青貯飼料中的碳水化合物轉化為有機酸，使青貯環境的pH值下降到3.8-4.2，抑制有害菌的生長，從而實現長期保存飼料及其營養物質的目的［11］。因此作為飼料添加劑的乳酸菌的產酸能力和產酸速度直接影響青貯品質。通過產酸性試驗對分離出的12株乳酸菌進行初步篩選，菌株B2-8產酸能力最強，接種4 h后pH已降到4以下，20 h后降到2.5，說明其能快速繁殖，創造酸性環境，在青貯初期具有優勢；除B1-4外其余菌株接種20 h后pH值均能下降到3.5以下，也具有良好的青貯潛能。

青貯時一些病原細菌、霉菌、酵母均可引起青貯飼料的腐敗變質，并且金黃色葡萄球菌引起的奶牛乳房炎，大腸桿菌和沙門菌引起的畜禽腸道腹瀉等問題至今仍未很好解決。通過抑菌試驗發現，所分離的乳酸菌上清液對霉菌均無抑制作用，對金黃色葡萄球菌的抑菌效果較為顯著，其中菌株B3-1抑菌譜寬，抑菌活性最佳，對供試病原細菌和酵母菌均有較好的抑菌作用，菌株B2-3和B2-8次之。本試驗所分離的乳酸菌對于改變上述問題提供了新的途徑。目前關于乳酸菌的抑菌機制主要認為是以下兩方面：一是認為乳酸菌的代謝產物具有抑菌作用［4］；二是乳酸菌通過伸出偽足狀絲狀物與小腸上皮細胞結合，起占位作用，從而阻擋有害菌的侵襲［12，13］。關于乳酸菌的抗真菌機制Anders等認為植物乳桿菌的代謝產物3-羥基脂肪酸具有優良的抗真菌能力。本試驗中所分離出的植物乳桿菌發酵上清液均無抑制真菌能力其原因還有待進一步的研究。目前青貯飼料添加劑主要是同質型和異質型乳酸球菌和桿菌的多菌混合應用，這是因為乳酸球菌和明串珠菌在青貯前期迅速發酵，從而為乳酸桿菌的生長提供有利條件。本研究所篩選出的B1-7和B5-2生長速度較快，2 h后就進入對數期，8 h后達到穩定期，符合上述要求。在此之后，片球菌和乳酸桿菌占主導地位，pH值下降到4.2以下只有乳酸桿菌大量繁殖，因此，篩選了B2-3和B1-6兩株戊糖片球菌以及B2-8和B3-1兩株植物乳桿菌。同質型乳酸菌和異質型乳酸菌混合應用主要是由于同質型發酵乳酸菌主要生成乳酸，營養成分損失少，產酸多且快，異質型乳酸菌除生成乳酸外還生成乙酸等有機酸和氣體，并產生熱量，造成營養物質的損失，但其產生的乙酸是一種比乳酸更有效的抗真菌及霉菌的酸類物質［14-16］，更能有效防止青貯飼料二次發酵和提高其有氧穩定性［17］。本試驗所篩選出的B1-6和B1-7為異型發酵乳酸菌，其余為同型發酵乳酸菌。青貯時適量的酵母可以使青貯飼料產生酒香味提高了青貯飼料的適口性，但是當青貯飼料開窖后酵母和氧氣接觸，大量繁殖并和乳酸菌競爭營養物質引起二次發酵破壞青貯飼料的有氧穩定性［18］。篩選的菌株除B1-7外其余菌株均對酵母有一定的抑制作用，這對改變二次發酵問題提供了可能。

本試驗篩出的B1-6、B1-7、B2-3、B2-8、B3-1和B5-2共6株乳酸菌有乳酸球菌和乳酸桿菌，有同質型乳酸菌和異質型乳酸菌，并且篩選出的6株乳酸菌具有較好的產酸能力和抑菌能力，以及具有優良的生物學特性和抗逆性，均為青貯用常見菌種，這對制備優良的青貯飼料添加劑提供了可能，對于各菌株之間如何搭配以及其添加劑量的確定還需要在后續試驗中做進一步的研究。

4 結論

本研究成功分離出12株乳酸菌，其中桿菌5株，球菌7株。經鑒定植物乳桿菌4株、發酵乳桿菌1株、屎腸球菌1株、腸系膜明串珠菌腸膜亞種1株、戊糖片球菌5株，其中菌株B1-4、B1-6、B1-7為異型發酵乳酸菌，其余菌株為同型發酵乳酸菌。菌株B1-6、B1-7、B2-3、B2-8、B3-1和B5-2顯示了較好的產酸能力和抑菌能力，具有良好的青貯潛力。

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