輔助菌共培養(yǎng)條件對(duì)橙色粘球菌次生代謝產(chǎn)物的影響

黃艷 胡建偉 朱紅惠

（1.塔里木大學(xué) 塔里木盆地生物資源保護(hù)利用兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，阿拉爾 843300；2.廣東省微生物研究所 廣東省華南應(yīng)用微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地 廣東省微生物菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東省微生物新技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室，廣州 510070）

粘細(xì)菌屬于δ-變形桿菌綱（Deltaproteobacteria），粘細(xì)菌目（Myxococcales），包括3個(gè)亞目，7個(gè)科，21個(gè)屬［1-3］，具有復(fù)雜的生活發(fā)育史，被認(rèn)為是高等原核生物［4，5］，僅次于放線菌之后又一具有開(kāi)發(fā)價(jià)值的藥源微生物［6-9］。然而粘細(xì)菌分離純化困難，生長(zhǎng)緩慢，次生代謝產(chǎn)物得率低［10］，嚴(yán)重制約了粘細(xì)菌研究工作的深入開(kāi)展。有研究表明，與其它類群細(xì)菌共培養(yǎng)，對(duì)粘細(xì)菌的生長(zhǎng)更有利［11］，這些細(xì)菌菌株被稱為輔助菌（helper bacteria）。Jacobi等［12］證實(shí)大部分軟骨霉?fàn)罹鷮伲–hondromyces）粘細(xì)菌的生長(zhǎng)都依賴于鞘脂桿菌屬（Sphingobacterium）的一種圓形細(xì)菌，只有后者存在時(shí)，前者才能正常生長(zhǎng)繁殖。然而輔助菌共培養(yǎng)對(duì)粘細(xì)菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物有何影響，目前仍不清楚。

本課題組在新疆鹽堿地環(huán)境中分離得到一株橙色粘球菌（Myxococcus fulvus），編號(hào)為8.5［13］，同時(shí)篩選到2株輔助菌，分別為42號(hào)和43號(hào)細(xì)菌，它們能被橙色粘球菌8.5捕食。本研究通過(guò)在液態(tài)培養(yǎng)方式下加入輔助菌與粘細(xì)菌共培養(yǎng)，研究輔助菌對(duì)橙色粘球菌次生代謝產(chǎn)物的影響，以期提高橙色粘球菌的次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)率。

1 材料與方法

1.1 材料

橙色粘球菌（M. fulvus）8.5菌株，微枝形桿菌屬（Microvirga sp.）細(xì)菌編號(hào)為42號(hào)，無(wú)色桿菌屬（Achromobacter sp.）細(xì)菌編號(hào)為43號(hào)輔助細(xì)菌均由本課題組分離鑒定得到，保存于廣東省微生物菌種保藏中心。

薄層層析采用煙臺(tái)市化學(xué)工業(yè)研究所的TLC高效薄層層析板（GF254）；離心機(jī)為Beckman的AvantiJ-20xp型離心機(jī)；分析色譜柱為Agilent C18柱（250 cm×4.6 mm）；高效液相色譜儀為Agilent 1260；色譜純甲醇和乙腈為Fisher Scientific公司生產(chǎn)，其他有機(jī)試劑均為分析純，購(gòu)于廣州化學(xué)試劑廠。

1.2 方法

1.2.1 橙色粘球菌最佳生長(zhǎng)培養(yǎng)基的選擇 選擇CY、Ht、Ht1和VY-2 四種培養(yǎng)基。將橙色粘球菌8.5分別接種于上述4種液體及固體培養(yǎng)基中，液體培養(yǎng)于30℃，150 r/min的恒溫?fù)u床中進(jìn)行，固體培養(yǎng)于30℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行。細(xì)菌接種后，每天觀察、記錄菌體的生長(zhǎng)情況，選擇最適宜其生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。

CY、Ht、Ht1和VY-2四種培養(yǎng)基的pH約為7.2，主要配方（以下為1 L培養(yǎng)基的配方，固態(tài)培養(yǎng)基加入1.5%-2%的瓊脂）如下。

CY培養(yǎng)基：酪蛋白胨0.3 g；酵母浸出粉0.1 g；CaCl2·2H2O 0.1 g。

Ht培養(yǎng)基：磷酸二氫鉀0.1 g；氯化鈣0.01 g；硫酸鎂0.03 g；硫酸亞鐵0.001 g；硝酸鈉0.25 g；可溶性淀粉2%。

Ht1培養(yǎng)基：磷酸二氫鉀0.1 g；氯化鈣0.01 g；硫酸鎂0.03 g；硫酸亞鐵0.001 g；硝酸鈉0.25 g。

VY-2培養(yǎng)基：安琪活性干酵母0.5 g；維生素B120.05 mg；氯化鈣0.1 g。

1.2.2 液態(tài)發(fā)酵時(shí)輔助菌最佳加入時(shí)間段的試驗(yàn) 選擇VY-2培養(yǎng)基進(jìn)行橙色粘球菌8.5與42號(hào)、43號(hào)輔助菌的共培養(yǎng)試驗(yàn)。將VY-2液體培養(yǎng)基分裝為25 mL/瓶的100 mL三角瓶中，共50瓶。將橙色粘球菌8.5適量接種于各瓶液體培養(yǎng)基中，于30℃，150 r/min震蕩培養(yǎng)7 d。將42號(hào)、43號(hào)輔助菌培養(yǎng)至12 h時(shí)，每隔12 h分別接種于上述生長(zhǎng)狀態(tài)良好的橙色粘球菌8.5的VY-2培養(yǎng)基中，接入時(shí)間分別為橙色粘球菌生長(zhǎng)至：0、12、24、48、60、72、84和96 h（0 h即為粘細(xì)菌與輔助菌同時(shí)接入，12 h即為粘細(xì)菌生長(zhǎng)12 h后接入輔助菌，依次類推），接種量為0.1 mL，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)做3個(gè)平行，每天觀察菌體生長(zhǎng)情況，空白對(duì)照（CK）為未接入輔助菌的橙色粘球菌8.5單獨(dú)培養(yǎng)。同樣，也將42號(hào)、43號(hào)細(xì)菌進(jìn)行相同方法的單獨(dú)培養(yǎng)。

培養(yǎng)7 d，收集發(fā)酵液，用低溫冷凍離心機(jī)4℃，6 000 r/min離心15 min后將菌體和上清分開(kāi)收集；收集菌體，離心后將離心管倒置數(shù)分鐘后，至無(wú)水分流出，用分析天平稱量，得到濕菌體得率；上清用等體積的乙酸乙酯充分萃取3次，乙酸乙酯相用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)、濃縮、干燥后，得到粗提物，空白對(duì)照及42號(hào)、43號(hào)菌的處理與之相同，得到粗提物的得率。

1.2.3 單獨(dú)培養(yǎng)及共培養(yǎng)時(shí)粗提物的HPLC分析 將最佳時(shí)間段加入輔助菌共培養(yǎng)后的發(fā)酵產(chǎn)物（乙酸乙酯相），8.5與42號(hào)、43號(hào)細(xì)菌單獨(dú)培養(yǎng)的發(fā)酵產(chǎn)物（乙酸乙酯相）取等量粗提物經(jīng)甲醇溶解后，用微孔濾膜過(guò)濾，進(jìn)行HPLC分析，方法為：流動(dòng)相溶劑為：A為0.2%的乙酸、水，B為甲醇，流速為1 μL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為214 nm。得到共培養(yǎng)與單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)代謝產(chǎn)物的變化情況分析圖譜。

2 結(jié)果

2.1 橙色粘球菌8.5最佳生長(zhǎng)的培養(yǎng)基

固體平板培養(yǎng)時(shí)，橙色粘球菌8.5可在Ht上生長(zhǎng)，Ht1上未能生長(zhǎng)，在CY和VY-2培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)狀態(tài)較好。在相同生長(zhǎng)時(shí)間中，橙色粘球菌8.5在CY培養(yǎng)基中的擴(kuò)展菌落圈更均勻，但菌層??；8.5在VY-2培養(yǎng)基中的擴(kuò)展菌落圈小，但中間菌落擴(kuò)展層厚，邊緣較?。▓D1）。

圖1 橙色粘球菌8.5在CY培養(yǎng)基（a）和VY-2培養(yǎng)基（b）的生長(zhǎng)第3天比較

如表1所示，在液體培養(yǎng)時(shí)，橙色粘球菌8.5在Ht和Ht1培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)狀態(tài)不佳，說(shuō)明僅有淀粉和無(wú)機(jī)鹽的寡營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基不足以滿足該橙色粘球菌8.5的生長(zhǎng)。8.5在CY和VY-2培養(yǎng)基中生長(zhǎng)情況良好。液態(tài)發(fā)酵時(shí)，測(cè)得乙酸乙酯相的粗提物得率分別為0.32 g/L和0.28 g/L。但考慮到工業(yè)化生產(chǎn)時(shí)VY-2較CY成本更低，因而，液態(tài)發(fā)酵時(shí)加入輔助菌最佳時(shí)間段的試驗(yàn)選用VY-2培養(yǎng)基。

2.2 液態(tài)發(fā)酵時(shí)加入輔助菌的最佳時(shí)間段

表1 橙色粘球菌8.5在不同生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)狀況比較

圖2 42號(hào)輔助菌共培養(yǎng)時(shí)加入時(shí)間點(diǎn)對(duì)橙色粘球菌生長(zhǎng)和次級(jí)代謝產(chǎn)物的影響

圖2-A顯示，空白對(duì)照（CK）：只在VY-2培養(yǎng)基加入粘細(xì)菌8.5發(fā)酵7 d得到的粗提物浸膏得率為0.24 g/L。0-96 h不同時(shí)間點(diǎn)加入42號(hào)輔助菌共培養(yǎng)使得粗提物得率均有所增加。增幅為：0.05-0.40 g/L。其中，72 h和84 h時(shí)加入42號(hào)輔助菌，發(fā)酵粗提物浸膏的得率最大，為0.64 g/L；圖2-B顯示，空白對(duì)照（CK）：只在VY-2培養(yǎng)基接入橙色粘球菌8.5發(fā)酵相同時(shí)間得到的濕菌體得率為14.88 g/L。42號(hào)輔助細(xì)菌與橙色粘球菌8.5共培養(yǎng)時(shí)，除12 h加入輔助菌共培養(yǎng)的濕菌體得率低于橙色粘球菌8.5單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)的濕菌體得率外，其他時(shí)間加入輔助菌共培養(yǎng)使得濕菌體得率均有提高，增幅為：0.28-9.68 g/L。72 h加入42號(hào)輔助菌共培養(yǎng)使得濕菌體得率最高，為24.55 g/L。

圖3 43號(hào)輔助菌共培養(yǎng)加入時(shí)間點(diǎn)對(duì)橙色粘球菌生長(zhǎng)和次級(jí)代謝產(chǎn)物的影響

圖3-A顯示，空白對(duì)照（CK）：只在VY-2培養(yǎng)基加入橙色粘球菌8.5發(fā)酵7 d得到的粗提物浸膏得率為0.24 g/L。0-96 h不同時(shí)間點(diǎn)加入43號(hào)輔助菌共培養(yǎng)使得粗提物得率均有所增加。增幅為：0-0.45 g/L。其中，橙色粘球菌8.5與43號(hào)輔助菌同時(shí)接入共培養(yǎng)時(shí)，發(fā)酵粗提物浸膏的得率最大為0.69 g/L；圖3-B顯示，空白對(duì)照（CK）：只在VY-2培養(yǎng)基接入橙色粘球菌8.5發(fā)酵相同時(shí)間得到的濕菌體得率為14.875 g/L。43號(hào)輔助細(xì)菌與橙色粘球菌8.5共培養(yǎng)時(shí)，濕菌體得率均有提高，增幅為：2.28-10.73 g/L。96 h加入43號(hào)輔助菌共培養(yǎng)使得濕菌體得率最高，為25.60 g/L。

對(duì)加入輔助菌共培養(yǎng)時(shí)，輔助菌自身能夠被橙色粘球菌8.5所捕食。對(duì)濕菌體得率及乙酸乙酯萃取后粗提物的得率進(jìn)行分析，結(jié)果表明，加入42號(hào)及43號(hào)輔助菌與橙色粘球菌8.5共培養(yǎng)時(shí)濕菌體得率及粗提物得率大體上均有所增加。其中，42號(hào)輔助菌72 h和84 h時(shí)加入共培養(yǎng)，發(fā)酵粗提物浸膏的得率最大為0.64 g/L；72 h加入共培養(yǎng)，濕菌體得率最高，為24.55 g/L；43號(hào)輔助細(xì)菌與橙色粘球菌8.5同時(shí)接入共培養(yǎng)時(shí)，粗提物得率最高為0.69 g/L，96 h加入共培養(yǎng)，濕菌體得率最高，為25.60 g/L。

2.3 不同輔助菌與橙色粘球菌8.5共培養(yǎng)的粗提物成分特征

圖4-A顯示，42號(hào)輔助菌與橙色粘球菌8.5共培養(yǎng)時(shí)的出峰情況相較于橙色粘球菌8.5單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)，基本一致；圖4-B顯示，43號(hào)菌與橙色粘球菌8.5共培養(yǎng)時(shí)，相較于橙色粘球菌8.5單獨(dú)培養(yǎng)產(chǎn)生的部分峰減少，如17.341 min，28.882 min，29.995 min，部分峰增多，如4.389 min。

綜合圖4-A、B可見(jiàn)，43號(hào)輔助菌相較于42號(hào)輔助細(xì)菌出峰更少，表明兩株細(xì)菌的代謝產(chǎn)物生成情況可能并不豐富。在保證粘細(xì)菌原有次生代謝產(chǎn)物基本一致時(shí)，應(yīng)該選擇42號(hào)輔助菌與橙色粘球菌8.5共培養(yǎng)為最佳輔助細(xì)菌。如若考慮得到4.389 min的代謝產(chǎn)物，則可選擇43號(hào)菌與橙色粘球菌8.5共培養(yǎng)。

3 討論

野生粘細(xì)菌的次級(jí)代謝物產(chǎn)量很低，給活性產(chǎn)物的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定等帶來(lái)很大困難［10］。很多研究者通過(guò)不同方法提高次級(jí)代謝產(chǎn)物得率：例如王寧等［14］通過(guò)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件優(yōu)化，劉迎等［15］通過(guò)加入次級(jí)代謝產(chǎn)物的粗提物作為誘導(dǎo)物均達(dá)到了提高次生代謝產(chǎn)物得率的效果。Margarita等［16］的研究發(fā)現(xiàn)輔助菌的加入能夠縮短布拉克須霉（Phycomyces blakesleeanus）的休眠時(shí)間，因此，本研究采用輔助菌與橙色粘球菌8.5共同培養(yǎng)的方法，嘗試解決粘細(xì)菌次級(jí)代謝產(chǎn)物得率低的問(wèn)題。研究發(fā)現(xiàn)，在粘細(xì)菌分泌次生代謝產(chǎn)物時(shí)，發(fā)現(xiàn)輔助菌的加入，能夠促進(jìn)橙色粘球菌的生長(zhǎng)，并可被橙色粘球菌所捕食，而不同時(shí)間加入輔助菌的作用效果不同，在最佳時(shí)間加入輔助菌會(huì)對(duì)代謝產(chǎn)物的得率產(chǎn)生更好的影響。對(duì)濕菌體得率而言，橙色粘球菌8.5培養(yǎng)至72 h加入42號(hào)輔助菌共培養(yǎng)最佳，培養(yǎng)至96 h加入43號(hào)輔助菌共培養(yǎng)最佳；對(duì)粗提物得率而言，橙色粘球菌8.5培養(yǎng)至72 h和84 h時(shí)加入42號(hào)輔助菌共培養(yǎng)最佳，橙色粘球菌8.5與43號(hào)輔助菌同時(shí)接入共培養(yǎng)最佳。黃兵［17］的研究證實(shí)共培養(yǎng)體系的成功建立關(guān)鍵在于兩株菌的接種時(shí)間及接種順序等，本試驗(yàn)結(jié)果也驗(yàn)證了這一結(jié)論。

圖4 不同輔助菌與橙色粘球菌共培養(yǎng)時(shí)HPLC分析圖譜

兩株輔助菌與橙色粘球菌8.5共培養(yǎng)后的次生代謝產(chǎn)物成分有所不同，42號(hào)輔助菌的加入基本不改變橙色粘球菌原有的次生代謝組分，43號(hào)輔助菌的加入能夠改變橙色粘球菌的部分次生代謝組分。郭鵬飛等［18］的研究表明海綿來(lái)源的微生物共培養(yǎng)可以產(chǎn)生新的活性代謝產(chǎn)物。這表明兩株輔助菌與橙色粘球菌共培養(yǎng)的作用機(jī)制不同。對(duì)粘細(xì)菌在加入輔助菌共培養(yǎng)后產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物組分不同的原因作以下幾點(diǎn)推測(cè)：（1）捕食行為引起次生代謝產(chǎn)物的變化，輔助菌被粘細(xì)菌捕食后，開(kāi)啟了不同于單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)新的代謝方式；（2）兩株菌株協(xié)同作用的結(jié)果，自然環(huán)境中微生物的互作現(xiàn)象普遍［19］，有研究表明，巨大芽孢桿菌胞外液能促進(jìn)產(chǎn)酸菌產(chǎn)酸［20］。本試驗(yàn)可能由于共培養(yǎng)的微生物在生長(zhǎng)過(guò)程中各自產(chǎn)生的酶類相互協(xié)同作用將同一底物轉(zhuǎn)化為另一物質(zhì)；（3）沉默基因的激活，Hopwood［22］在1980年初提出通過(guò)菌株或種間自然接合等方法可以激活某些沉默的抗生素相關(guān)基因，從而獲取新抗生素和新活性物質(zhì)。

4 結(jié)論

本研究采用輔助菌與橙色粘球菌共培養(yǎng)方式研究對(duì)次級(jí)代謝產(chǎn)物的影響，加入的輔助菌能夠被粘細(xì)菌捕食。發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)后能夠總體上增加橙色粘球菌的生物量及次生代謝產(chǎn)物得率；42號(hào)輔助菌的加入基本不改變橙色粘球菌原有的次生代謝組分，43號(hào)輔助菌的加入能夠改變橙色粘球菌的部分次生代謝組分。但試驗(yàn)仍存在缺陷，未能找到使橙色粘球菌代謝產(chǎn)物形成更為豐富的輔助菌。篩選已有粘細(xì)菌的輔助菌株，進(jìn)行與粘細(xì)菌共培養(yǎng)研究，將有利于促進(jìn)粘細(xì)菌資源的開(kāi)發(fā)與利用。

［1］ Dawid W. Biology and global distribution of Myxobacteria in soils ［J］. FEMS Microibiol Rev, 2000, 24（4）：403-427.

［2］ Shimkets LJ, Dworkin M, Reichenbach H, et al. The Myxobacteria ［J］. The Prokaryotes, 2006（7）：31-115.

［3］ Garcia RO, Reichenbach H, Ring MW, et al. Phaselicystis flava gen. nov., sp. nov., an arachidonic acid-containing soil myxobacterium, and the description of Phaselicystidaceae fam. nov［J］. Int J Syst Evol Microbiol, 2009, 59（6）：1524-1530.

［4］ 蔣德明, 周秀文, 田曉翔, 等.基于16S rRNA和HSP60基因序列分析粘細(xì)菌孢囊桿菌亞目形態(tài)分類的種屬之間的親緣關(guān)系［J］.微生物學(xué)報(bào), 2008, 48（6）：711-716.

［5］ Kaiser D. Myxococcus from single cell polarity to complex multicellular patterns ［J］. Annual Review of Genetics, 2008, 42：109-130.

［6］ Zusman DR, Scott AE, Yang Z, et al. Chemosensory pathways, motility and development in Myxococcus xanthus ［J］. Nature Reviews Microbiology, 2007, 5（11）：862-872.

［7］ Gerth K, Pradelia S, Perlova O, et al. Myxobacteria：proficient producers of novel natural products with various biological activities-past and future biotechnological aspects with the focus on the genus Sorangium ［J］. Journal of Biotechnology, 2003, 106（2-3）：233-253.

［8］ Kim J, Choi J N, Kim P, et al. LC-MS/MS profiling-based secondary metabolite screening of Myxococcus xanthus ［J］. Journal of Microbiology Biotechnology, 2009, 19（1）：51-54.

［9］ Krug D, Zurek G, Revermann O, et al. Discovering the hidden secondary metabolome of Myxococcus xanthus：a study of intraspecific diversity［J］. Applied and Environmental Microbiology, 2008, 74（10）：3058-3068.

［10］ 徐鳳.粘細(xì)菌Sorangium cellulosum AHB103-1產(chǎn)生新型抗腫瘤物質(zhì)的研究［D］.無(wú)錫：江南大學(xué), 2011.

［11］ Pinoy PE. On the necessity of a bacterial association for the development of the myxobacterium, Chondromyces crocatus［J］. Compt Rend Soc Biol, 1913, 157：77-78.

［12］ Jacobi CA, Assmus B, Reichenbach H, et al. Molecular evidence for association between the sphingobacterium-like organism “Candidatus comitans” and the myxobacterium Chondromyces crocatus［J］. Applied and Environmental Microbiology, 1997, 63（2）：719-723.

［13］ 張鮮姣, 黎志坤, 朱紅惠, 等. 新疆阿克蘇地區(qū)鹽堿地粘細(xì)菌分離鑒定［J］. 微生物學(xué)報(bào), 2012, 52（2）：160-168.

［14］ 王寧, 馬秋剛, 計(jì)成, 等.黏細(xì)菌降解黃曲霉毒素B1的產(chǎn)酶條件優(yōu)化［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2009, 14（2）：27-31.

［15］ 劉迎, 馬中良, 王旻.海濱土壤黏細(xì)菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的性質(zhì)及產(chǎn)量調(diào)控的研究［J］.微生物學(xué)通報(bào), 2006, 33（3）：42-46.

［16］ Margarita O, Teresa S, Arturo PE. Helper strains for shortening the dormancy in Phycomyces blakesleeanus ［J］. Current Genetics, 1985, 9（5）：369-372.

［17］ 黃兵.放線菌共培養(yǎng)效應(yīng)及活性產(chǎn)物誘導(dǎo)的研究［D］.北京：北京化工大學(xué), 2010.

［18］ 郭鵬飛, 靳艷, 張海濤, 等.共培養(yǎng)海綿微生物誘導(dǎo)抗菌活性物質(zhì)的研究［J］.微生物學(xué)通報(bào), 2006, 33（1）：33-37.

［19］ Burgess JG, Jordan EM, Bregu M, et al. Microbial antagonism：A neglected avenue of natural products research ［J］. Marine Bioprocess Engineering, 1999, 35：27-32.

［20］ 張舟.維生素C二步發(fā)酵中伴生菌的研究［D］.沈陽(yáng)：中國(guó)科學(xué)院沈陽(yáng)應(yīng)用生態(tài)研究所, 2000.

［21］ Hopwood DA, Chater KF, Hugo WB, et al. Fresh approaches to antibiotic production ［J］. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 1980, 290（1040）：313-328.