SC-04抗生素的生物活性測定

李文斌 李增波 劉仙俊

（太原科技大學化學與生物工程學院，太原 030021）

生物農藥易被自然界分解而不污染環境，能耗低、投資少，因此，利用微生物產生的生物活性物質作為開發生物農藥的研究受到了世界各國的極大重視［1-3］。近年來，阿維霉素在農業上的成功應用，引起了人們對農用抗生素開發的濃厚興趣［4，5］。通過對本實驗室分離保存的菌樣進行平板抑菌試驗、離體組織和大田測定試驗發現SC-04菌發酵液對辣椒疫霉、草莓枯萎等園藝作物病害具有良好的防治效果。本研究通過對SC-04菌發酵液的穩定性分析及其抗菌物質的極性分析，優化其生物活性物質SC-04抗生素的分離提取方法，對抑菌譜進行分析，研究對辣椒早疫病菌和辣椒疫霉病菌等大多數病原真菌的抑制效果，旨在為開發其利用價值提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 抗生素產生菌 SC-04菌發酵液。

1.1.2 培養基

1.1.2.1 種子培養基（g/L） 蔗糖10，酵母膏5，牛肉膏3，蛋白胨3，CaCO32，水1 000 mL，pH7.2。

1.1.2.2 發酵培養基（g/L） 黃豆粉34，淀粉10，蔗 糖2，魚 粉10，K2HPO41，MgSO4·7H2O 0.5，CaCO32，ZnSO40.01，FeSO4·7H2O 0.01，NaCl 2，水1 000 mL，pH7.2。

1.1.3 主要試劑 分析純甲醇、丙酮、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇均由天津市化學試劑三廠生產；青霉素、鏈霉素、四環素、紅霉素均由華北制藥集團生產。

1.1.4 靶標菌 辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici）；辣椒早疫病菌（Alternaria solani）；小麥赤霉病菌（Fusarium graminearum）；葡萄灰霉病菌（Botrytis cinerea Pers）；黃瓜炭疽病菌（Colletotrichum lagenarium）；西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum）；葡萄炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）；黃瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum）；煙草赤霉病菌（Fusarium graminearum）；水稻稻瘟病菌（Pyricularia oryzae）；白菜炭疽病菌（Colletotrichum higginsianum Sacc）；白菜黑斑病菌（Alternaria brassicicola）；番茄黑霉病菌（Botrytis cinerea）；番茄灰霉病菌（Botrytis cinere）；棉花枯萎病菌（F. f. sp. vasinfectum）；草莓枯萎病菌（Fusarium oxysporium Schl）；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureaus）；埃希氏大腸桿菌（Escherichia coli）；青霉（Penicillium）；黑曲霉（Aspergillus niger）。以上菌種均由本實驗室從中國工業微生物菌種保藏管理中心購得。

1.2 方法

1.2.1 發酵濾液的穩定性分析

1.2.1.1 時間穩定性測定 將SC-04菌株發酵濾液于常溫下保存1、7、30和90 d，以辣椒疫霉為病原指示菌，以發酵原液作為對照，以生長速率法即抑菌活性試驗測定其相對抑菌率（%）［20，21］，根據活性損失率來確定保存時間穩定性。

1.2.1.2 熱穩定性測定 將SC-04菌株發酵濾液于70℃和100℃下分別處理10、30和60 min，同時在121℃下處理30 min，以辣椒疫霉為病原指示菌，以發酵原液作為對照，參照前述生長速率法測定其相對抑菌率（%），根據活性損失率來確定其熱穩定性。

1.2.1.3 酸堿穩定性測定 將SC-04菌株發酵濾液用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH調整pH為1-14，25℃下保存6 h后再調回初始pH（8.3），以辣椒疫霉為病原指示菌，以發酵原液作為對照，參照前述生長速率法測定其相對抑菌率（%），根據活性損失率來確定其酸堿穩定性。

1.2.1.4 UV穩定性測定 將SC-04菌株發酵濾液與培養基按1∶10的比例混合，待平板凝固后，在超凈臺上用紫外燈照射20 min，以辣椒疫霉為病原指示菌，以未照紫外線的平板作為對照，參照前述生長速率法測定其相對抑菌率（%），根據活性損失率來確定其酸堿穩定性。

1.2.2 抗菌物質極性分析 將100 mL發酵上清液加入等體積的石油醚、氯仿、乙酸乙酯及正丁醇的三角瓶中，于室溫置于搖床振蕩，充分混合。靜置過夜，分別測定上層有機相和下層水相的抑菌活性。

1.2.3 抑菌譜測定 將發酵粗提物用甲醇溶解后，采用濾紙片法進行粗提物的活性檢測。

2 結果

2.1 發酵濾液的穩定性分析

2.1.1 常溫下的穩定性 發酵濾液常溫保存較長時間活性損失很小，保存90 d時，活性損失率僅為14.8%（表1），說明SC-04菌株常溫下穩定性較好。

表1 不同保存時間的發酵液抑菌率

2.1.2 熱穩定性 SC-04菌株發酵液具有較強的熱穩定性。隨著各溫度（70℃和100℃）熱處理時間延長，活性損失率呈升高趨勢；在70℃和100℃下處理10 min，活性損失率分別為14.6%和19.4%，二者相比差距不大，與對照相比，活性損失不顯著；121℃下處理30 min活性損失率為63.3%，與對照相比，活性損失較大（表2）。因此，發酵液的預處理應控制在合適的溫度和時間內。

表2 不同熱處理的發酵濾液抑菌率

2.1.3 酸堿穩定性 由表3可知，SC-04菌株發酵液在pH4.0-12.0以內活性差異不大，其活性損失率不超過20%；與對照相比，當酸堿度過高時，即在pH<3.0或pH>12.0時活性損失率明顯提高。因此，在不影響活性的前提下，可通過控制發酵液的酸堿度來改變發酵液的流變性，以利于對SC-04菌株發酵產物有效組分的分離提取工作的進行。

表3 不同pH的發酵濾液抑菌率

2.1.4 UV穩定性 發酵液經紫外線（UV）照射后抑菌率為75.7%，未經UV照射的抑菌率為76.4%，其抑菌情況見圖1。當發酵濾液經紫外線照射30 min后，抗菌活性物質的穩定性有所下降，但影響不大，該活性物質對紫外線基本穩定。

圖1 UV穩定性結果

2.2 發酵液預處理方法的建立

發酵結束后，發酵液除含有所需要抗生素外，還存在大量的菌體和各種代謝產物等，這些雜質不僅使發酵液黏度增高，而且還會影響后續的提取操作。為改善發酵液的流變特性，同時除去對后續純化操作有影響的雜質，常常需要預處理。發酵液中還含有某些無機鹽，會直接影響成品質量（灰分增高），因此預處理也應將有影響的無機離子，特別是高價金屬無機離子，如Ca2+、Fe3+和Mg2+除去。從該發酵液穩定性試驗結果來看，該菌株有較好的熱和酸堿穩定性，因此將原始發酵液5 000 r/min離心得上清液，上清液用草酸調pH到6.0，70℃下處理10 min，離心沉淀得發酵上清液。

2.3 抗菌物質的極性分析

發酵上清液的萃取結果（表4）表明，發酵液中的抗菌物質能溶于氯仿、乙酸乙酯等極性較強的有機溶劑，且乙酸乙酯的萃取效果更好，而不溶于非極性溶劑石油醚和強極性溶劑正丁醇。根據相似相溶原理，可大致判斷該抗菌物質極性較強，同時發酵上清液萃取試驗結果顯示，活性物質既能溶于水又能溶于溶媒，是一種脂溶-水溶性抗生素，一般可采用脂溶性抗生素提取。鑒于該物質能被氯仿和乙酸乙酯萃取，且乙酸乙酯比氯仿萃取效果好，確定發酵上清液可以采用乙酸乙酯為溶劑進行萃取。

表4 發酵液上清萃取試驗結果

2.4 抗菌粗提物的抑菌譜測定

SC-04發酵液乙酸乙酯粗提物的抑菌譜很廣，其對大多數病原真菌都有較好的抑制效果，抑菌圈直徑都在10 mm以上，其中辣椒早疫病菌和辣椒疫霉病菌的抑菌圈直徑分別為32 mm和30 mm（表5）。

3 討論

農用抗生素是現代生物技術和化學工程結合發展的產品，易被土壤微生物分解而不污染環境，對人畜安全，選擇性高，在農業病蟲害的防治上具有廣闊的發展前途［6-10］。由于自然界微生物種類繁多，從中尋找有特殊生理活性的物質還有很大潛力。農用抗生素由微生物發酵產生，在抗生發酵液中，除抗生活性物質外還含有很多其它物質［11，12］。因此還必須對其進行分離純化來進一步研究其各種理化性質。目前抗生素的提取精制方法有吸附法、溶媒萃取法、離子交換法、沉淀法外，還經常采用逆流分配法、色譜法、高壓液相層析等分離純化方法［13-17］。對抗生素進行分離純化之前，應對抗菌有效成分做一些初步試驗，了解其熱、酸堿穩定性及UV穩定性，判斷其電離特征等［19-21］，在確保分離純化過程中活性成分不失活的前提下，確定其最佳分離提取方法。

表5 SC-04號粗取物的抑菌譜

4 結論

通過SC-04菌發酵液的穩定性分析，確定了發酵液的預處理方法。將原始發酵液5 000 r/min離心得上清液，上清液用草酸調pH至6.0，70℃條件下處理10 min，離心沉淀得發酵上清液。抗菌物質的極性分析確定乙酸乙酯為該抗生活性物質的最佳提取溶劑。該抗生物質抑菌譜較廣，對辣椒早疫病菌和辣椒疫霉病菌等大多數病原真菌都有較好的抑制效果，且抑菌活性較強。

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