從非變性聚丙烯酰胺凝膠中快速高效回收DNA片段

周頤 王憶平

（北京大學生命科學學院，北京 100871）

在分子生物學試驗中，常常要對通過PCR擴增獲得的目的DNA片段進行回收和純化，除去非特異性的DNA片段［1］。鑒于瓊脂糖凝膠電泳的分辨率在回收小片段DNA時存在較大的局限性［2，3］，小片段DNA的回收純化往往需要借助于分辨率更高的聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）或高效液相色譜（HPLC），以滿足分子生物學中要求較高的試驗［4，5］。雖然高效液相色譜是一個強有力的分析工具，但使用其回收DNA耗時長，價格昂貴且只能單線程操作［6］，而聚丙烯酰胺凝膠電泳由于耗時短，價格經濟，同時可操作回收多個樣品且易掌握，被廣泛應用于小片段DNA的回收純化［7，8］。

針對從聚丙烯酰胺凝膠電泳中回收目的DNA，目前報道了幾種常用的回收方案（擠壓回收法［9］、凝膠浸泡法［10］、磁珠法［11］等），并且生物公司（Qiagen，OMEGA，Biospin等）也研發了相應的回收試劑盒，但冗繁的操作流程和高昂的費用以及時間成本，極大地限制了它們的使用。考慮到從PAGE凝膠中回收DNA的困難，主要在于以C-C鍵聚合的PAGE膠，其分子結構非常緊密，在高溫下又不會像瓊脂糖一樣熔化［12］，而擠壓、凝膠浸泡等方法由于耗時久，膠的破碎度低，限制了DNA的釋放，回收效率差。本試驗綜合考慮了以上存在的問題，結合前人的研究成果［13-15］，探索一種簡單快捷的通過增強PAGE凝膠的破碎度，從非變性聚丙烯酰胺凝膠中最大程度地釋放并回收純化DNA片段的方法，并將回收后的DNA樣本用于后續的凝膠阻滯試驗，旨在驗證這種純化方法的實用性和可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

長度在186-200 bp，通過限制性內切酶EcoR I，Hind III克隆到pUC18載體上的大腸桿菌merR的一系列啟動子。

Bio-Rad 30%（29∶1）丙烯酰胺儲液，ddH2O，過硫酸銨，TEMED，6×loading buffer（0.25%溴酚藍、0.25%二甲苯青、40%蔗糖），Trans2K DNA ladder marker，Easy Pfu supermix，無水乙醇或異丙醇，醋酸鈉（pH5.2，3 mol/L），Tiangen瓊脂糖膠回收試劑盒，Roche DIG Gel Shift Kit（2ndGeneration），天恩澤溴化乙錠（EB）清除劑，天恩澤PAGE回收DNA試劑盒，GE Health NanoDrop ND-1000。

1.2 方法

1.2.1 PCR擴增目的片段 使用Bio-Rad PCR儀C1000進行DNA片段擴增。50 μL反應體系包括：25 μL全式金2×Easy Pfu supermix，正反向引物（10 μmol/L）各1 μL，質粒模板1 μL，50 ng，ddH2O 22 μL。反應條件：94℃ 2 min；94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 15 s，30個循環；72℃ 10 min。

1.2.2 PAGE膠電泳 6%濃度的非變性PAGE膠的制備參照分子克隆（第3版）［1］（不同大小的DNA片段應選擇適宜的凝膠濃度）。取10 μL 1%瓊脂糖切膠回收的PCR產物加入2 μL 6×loading buffer（0.25%溴酚藍，0.25%二甲苯青，40%蔗糖），混勻上樣。150 V恒壓電泳至二甲苯青接近膠板3/4處停，室溫電泳即可，冰浴效果更佳。

1.2.3 溴化乙錠染色 小心撬開玻璃板，將膠輕輕撥入盛有0.5 μg/mL溴化乙錠的容器中，室溫染色10 min。染色完畢后，用清水小心洗脫非特異性結合于凝膠上的溴化乙錠。

1.2.4 從PAGE中回收純化DNA片段 在凝膠尚未干燥時，用干凈的手術刀片將待回收的目的DNA片段小心的切割下來，放入干凈的小號研缽中。若PAGE膠已經干燥并卷邊，可將凝膠重新放入裝有雙蒸水的培養皿中，于脫色搖床上搖動約5 min，即可重新獲得平整的凝膠用于切膠回收。將液氮小心的注入盛有目的DNA凝膠的研缽中，待液氮揮發，用干凈的小號瓷杵，將固化后的凝膠碾成均勻的粉末，加入2倍膠體積的去離子水，用1 mL的移液器，充分吹吸混勻并轉移至1.5 mL的eppendorf管中，14 000×g室溫離心10 min。吸取上清至新的1.5 mL eppendorf管中，加入2倍體積預冷的無水乙醇或70%體積的異丙醇，1/10體積的3 mol/L的醋酸鈉（pH5.2），-20℃靜置20 min，14 000×g離心15 min。棄上清，預冷70%濃度乙醇漂洗2次（亦可更多次），真空抽干或室溫待乙醇揮發完全，去離子水溶解即可，如需要去除溴化乙錠，可加入溴化乙錠清除劑處理24 h。

2 結果

2.1 目的DNA片段的獲取

大腸桿菌merR系列啟動子經由PCR擴增，產物通過1%的瓊脂糖回收膠電泳檢測的結果（圖1）顯示，目的DNA片段（大小在196-200 bp之間）通過PCR得到了有效地擴增，并且在1%的瓊脂糖回收膠的分辨率下，除了目的條帶以外，沒有非特異性擴增的條帶。

圖1 PCR目的DNA片段1%瓊脂糖電泳圖（回收膠）

2.2 兩種回收目的DNA方法的比較

將圖1中的目的條帶從1%的瓊脂糖回收膠上切下來，使用Tiangen瓊脂糖膠回收試劑盒加以回收，回收產物經由1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果（圖2）顯示，回收的目的片段為單一DNA條帶。

圖2 瓊脂糖凝膠回收純化DNA的檢測（1%瓊脂糖電泳）

同時將圖2中的樣品（即瓊脂糖切膠回收后的DNA片段），上樣于濃度為6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（圖3）。比較圖2和圖3可以看出，瓊脂糖電泳檢測特異的單一條帶經聚丙烯酰胺電泳后出現多條非特異性條帶，這些非特異性條帶可能會影響后續的凝膠阻滯試驗的結果。

圖3 瓊脂糖凝膠回收純化DNA的檢測（6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳）

將圖1中的PCR擴增產物直接用于非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，接著進行回收純化，得到圖4的結果。由圖4中的條帶可見，經過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳回收純化后，可以有效地消除非特異性條帶的干擾。

圖4 聚丙烯酰胺凝膠回收純化DNA的檢測（6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳）

2.3 兩種方法回收的DNA應用在凝膠阻滯試驗檢中的效果比較

進一步用凝膠阻滯試驗檢測不同方法下所回收的DNA片段的特異性情況。將圖2中的啟動子DNA樣品用于凝膠阻滯試驗（圖3），檢測啟動子與轉錄調控蛋白CRP之間的相互作用，結果見圖5。

圖5 瓊脂糖凝膠回收純化DNA用于和CRP蛋白的凝膠阻滯電泳圖

從圖5可以看出，除了最下面的free DNA條帶和最上面的目的阻滯條帶以外，還有多條非特異的阻滯條帶，這是由于不純的DNA與蛋白間的非特異性結合造成的。而通過聚丙烯酰胺凝膠回收純化的DNA用于同樣的凝膠阻滯試驗，發現除了單一目的阻滯帶以外，沒有其他非特異的阻滯帶出現（圖6）。

圖6 聚丙烯酰胺凝膠回收純化DNA用于和CRP蛋白的凝膠阻滯電泳圖

2.4 三種不同方法回收DNA的定量評估

從電泳結果可以看出，同一DNA樣本，通過PAGE回收純化的DNA在純度和特異性上，顯著高于應用瓊脂糖方法回收純化的DNA。與此同時，DNA的回收率也是我們最為關心的指標之一。針對不同方法回收到的DNA得率的評估，在此將圖1中的兩個不同的PCR產物，平均分為一式3份（每份100 μL），通過3種方法加以回收（最后回收到相同溶解體積50 μL）：a. Tiangen瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收；b.天恩澤PAGE回收DNA試劑盒回收（浸泡煮沸法）；c.利用“1.2方法”中PAGE回收，通過NanoDrop儀器來檢測。用于校準零點的去離子水中也相應加入了溴化乙錠清除劑，以保持與回收的DNA樣本中的一致性，結果見表1。

表1 三種不同方法回收DNA濃度及純度的比較

從表1中可以了解到，將樣品A和樣品B通過3種方法回收后，用PAGE回收試劑盒回收的DNA濃度最低，其次是通過瓊脂糖回收試劑盒回收的DNA，而采用本研究“1.2方法”中回收所獲得的DNA濃度最高，且通過該方法回收的DNA在純度上與兩種回收試劑盒回收獲得的DNA純度相當。

3 討論

盡管近年來有許多關于DNA回收、純化方法的報道和比較，但基本上這些方法都是基于瓊脂糖凝膠的回收和純化方法的改良，針對從PAGE膠中回收和純化DNA方法的報道極少［16-18］。由于聚丙烯酰胺凝膠在高溫下不熔，強韌致密的結構又限制了DNA的釋放，煮沸、擠壓、搗碎、浸泡的處理都不甚理想，嚴重影響了回收效率［12］。就目前報道的方法來看，有的回收率低，有的操作繁瑣，有的價格昂貴，因此完善而高效的回收方案亟待探索。本試驗在沿用一貫采用的乙醇沉淀DNA方法的基礎上，借助液氮對聚丙烯酰胺凝膠的固化作用，通過研磨固化后的凝膠成粉末，破壞凝膠的結構，最大限度的從凝膠中釋放DNA，從而提高DNA的回收率。與以往報道的回收DNA片段的方法不同的是：由于不需要反復擠壓、浸泡PAGE膠，整個試驗所需操作時間短，隨即避免了因凝膠長時間浸泡以及煮沸法而導致DNA降解［15］；盡管磁珠法回收DNA效率高，但磁珠價格昂貴，提高了試驗成本［11］，而本方法則沒有耗材依賴性；無需借助組織研磨儀等高級器材［14］，摒棄了對儀器的依賴性。

在定量評估不同方法回收DNA的效率上，本研究的方法相較于另外兩種方法而言，能夠獲得較高的DNA濃度，且維持與試劑盒純化回收的DNA相當的純度。通過一般PAGE試劑盒回收DNA得率低的原因主要是：搗碎、浸泡、煮沸的方法無法最大限度釋放PAGE膠中的DNA，導致溶解在液相中待回收DNA樣品量降低；用瓊脂糖回收試劑盒回收的DNA，得率高于用PAGE回收試劑盒回收的結果，但仍低于“1.2方法”中所獲得的DNA，究其原因，是因為吸附柱上的DNA在較小洗脫體積時不能最大限度的洗脫下來，仍有部分DNA殘留在洗脫柱上，而如果用較大體積洗脫，固然能獲得最大量的總DNA，卻犧牲了單位體積的DNA濃度，不能達到試驗的要求。

使用本方法回收純化DNA要注意的是：（1）當用雙蒸水充分溶解被研磨成粉末中的DNA，并通過離心分離上清和下層膠碎片后，在用移液器吸取上清的過程盡量不要吸入下層碎片，以免影響乙醇沉淀的效果；（2）為了加大上樣量，可以在配膠時使用1.5 mm的梳子，或者將樣品先通過瓊脂糖電泳回收濃縮再上樣聚丙烯酰胺凝膠電泳；（3）切膠用的刀片要干凈，所切條帶要盡量細；（4）用于研磨的研缽要清洗干凈，避免DNA交叉污染；（5）無水乙醇，醋酸鈉和75%的乙醇都要提前預冷。由于本試驗中所研究的目的DNA長度約有200 bp，而分子生物學研究中往往要用到更短的DNA片段（< 50 bp），如果通過本方法回收純化這類小片段，首先要選擇合適的丙烯酰胺儲液（丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺混合液，19∶1），同時提高用于電泳的聚丙烯酰胺膠的濃度以加大分辨率，另外在乙醇沉淀的過程中要相應地延長冰浴時間和離心時間。對于單鏈寡核苷酸的回收也可參考使用本方法，考慮到用于分離單鏈寡核苷酸的凝膠中含有尿素，因此在最后洗滌的時候要相應多洗滌兩次以除去尿素。

4 結論

通過研磨固化的凝膠以最大限度釋放凝膠中的DNA，從而快速高效地從非變形聚丙烯酰胺凝膠中回收DNA片段的方法。通過不同試驗手段檢測，該方法回收純化的DNA特異性強，得率高，純度較好。因此，對于那些需要高純度DNA樣品的分子生物學試驗而言，是一種簡單經濟，能夠被廣大的實驗室所采納接受的方法。

［1］ Sambrook J, Russell DW. Molecular cloning：A laboratory manual. 3rd ed ［M］.New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001：636-648.

［2］ 趙培, 王振英, 彭永康.瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠電泳技術檢測小麥基因組DNA RAPD擴增產物的方法學比較［J］.中國生物工程雜志, 2003, 23（8）：96-100.

［3］ 王霞, 王燁, 李琳琳, 等.瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測腸道菌群基因擴增產物的方法學比較研究［J］.新疆醫學, 2008, 38：136-138.

［4］ 翟紅, 劉慶昌.甘薯胚性懸浮細胞遺傳轉化的研究［J］.中國農業科學, 2003, 36：487-491.

［5］ Hideaki T, Hiroji A. A common role of CRP in transcription activation：CRP acts transiently to stimulate events leading to open complex formation at a diverse set of promoters ［J］. The EMBO Journal, 1998, 17：1759-1767.

［6］ 黎朋.熒光標記DNA片段高效液相色譜質譜分析及熒光特性研究［D］.北京：生物能源與環境計量科學和測量技術研究所, 2010.

［7］ Xu M, Busby SJW. Activation and repression at the Escherichia coli ynfEFGHI operon promoter ［J］. Journal of Bacteriology, 2009, 191（9）：3172-3176.

［8］ Seoh HK, Tai PC. Catabolic repression of secB expression is positively controlledby cyclic AMP （cAMP） receptor protein-cAMP complexes at the transcriptional level ［J］. Journal of Bacteriology, 1999, 181（6）：1892-1899.

［9］ 薛仁鎬, 金圣愛, 孫世孟, 等.瓊脂糖凝膠中DNA片段的擠壓回收法.生物技術, 2006, 16（3）：50-51.

［10］ 王春, 陳琳玲, 許燦新, 等.簡便快速的PCR產物回收方法［J］.南華大學學報, 2005, 33（1）：109-111.

［11］ 楊百全, 王利君, 遇長春, 等.磁珠法回收純化DNA樣本［J］.中國法醫學雜志（增刊）, 2006（1）：10-11.

［12］ 蔣志飛.活性自由基聚合法制備聚丙烯酰胺及其水凝膠的研究［D］. 重慶：重慶大學, 2007

［13］ 高傳軍.一種從聚丙烯酰胺凝膠上回收D N A片段的簡易方法［J］.科技信息, 2009, 19：6

［14］ 朱玉君, 樊葉楊, 莊杰云.從非變性聚丙烯酰胺凝膠回收純化DNA樣本［J］.生物技術通報, 2010（1）：193-195.

［15］ 章蕾, 袁玲, 劉仲華, 等.從非變性聚丙烯酰胺凝膠中回收DNA小片段的兩種方法比較［J］.中國農學通報, 2011, 27：227-230.

［16］ 朱曉峰, 安小平, 陳錦輝, 等.一種簡便、高效、經濟的從凝膠中回收DNA的方法［J］.生物技術通訊, 2006, 17：603 -604.

［17］ 莊飛云, 茅淑敏, 婁群峰, 等.簡便實用的瓊脂糖凝膠回收DNA片段方法［J］.生物技術通訊, 2003, 14（3）：202-203.

［18］ 蔣安, 梁慧, 陳旭, 等.回收瓊脂糖凝膠中DNA的簡便方法［J］.生物技術通報, 2006（2）：102-103.