豆粕酶解過程中蛋白質分子亞基組成及其抗原性變化

王章存，李樂靜，袁道強，崔勝文，趙學偉，王吉中，胡金強

(鄭州輕工業學院食品與生物工程學院，河南 鄭州 450002)

大豆以其豐富的蛋白質含量、合理的氨基酸組成和保健功能而深受人們的喜愛，大豆蛋白食品的種類也越來越多。大豆是公認的八大食物過敏源之一[1-2]，它可導致人體腹瀉、皮膚發紅等過敏反應，對嬰幼兒的影響更為嚴重[3]。因此，大豆的食品安全問題在國內外均受到高度關注。研究表明，7S和11S球蛋白是大豆中的主要蛋白質，其中豆球蛋白(glycinin)和β-伴球蛋白(β-conglycinin)也是抗原性較高的蛋白質。β-伴球蛋白是分子質量為140～180ku的糖蛋白，由α、α’和β 3種亞基(分子質量分別為58～77ku、58～83ku、42～53ku)按一定方式組合而成的三聚體[4-5]，豆球蛋白是分子質量為300～380ku的六聚體復合物，每個亞基由酸性(分子質量為31～45ku)和堿性(分子質量為18～20ku)多肽鏈通過－S－S－連接組成[6]。大豆蛋白的抗原性主要與這些蛋白質亞基結構及其形成的抗原決定簇有關[7-8]。

豆粕是提取大豆蛋白的主要原料，也是動物飼料中不可缺少的蛋白質原料。由于豆粕中含有抗原蛋白，在幼小動物飼料中的添加量受到很大限制。因此降低豆粕中的抗原活性是近年來國內外營養學研究的熱點。文獻中關于大豆蛋白酶解研究較多，但主要以大豆分離蛋白為研究對象，且以改善大豆蛋白溶解、乳化等功能特性為目的，較少涉及酶解過程中大豆蛋白分子結構與抗原性變化的關系[9-12]。本實驗以低溫脫脂豆粕為原料，選用堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶3種不同來源的酶制劑，通過SDS-PAGE和雙抗體夾心法ELISA分析了豆粕酶解過程中大豆蛋白分子亞基組成、含量和抗原性的變化等，比較不同酶制劑降解大豆蛋白抗原性的效果，旨在為制備低抗原性酶解豆粕提供理論和技術基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂豆粕(蛋白質含量45.80%) 山東嘉華油脂有限公司。

堿性蛋白酶(Alcalase，2.4AU/g)、胰蛋白酶(3.3AU/g)丹麥諾維信公司；木瓜蛋白酶(≥50U/g) 北京索萊寶科技有限公司；三羥甲基氨基甲烷(Tris)、巰基乙醇(ME)、十二烷基硫酸鈉(SDS) 美國Sigma公司；丙烯酰胺(Acr)、N,N'-亞甲基雙丙烯酰胺(Bis) 美國Amresco公司；N,N,N',N'-四甲基乙二胺(TEMED)、考馬斯亮藍R250 瑞士Fluka公司；低分子質量標準蛋白(14400～97400u) 中國科學院上海生物化學研究所；大豆抗原蛋白酶聯免疫分析(ELISA)試劑盒(96孔) 日本Nippon肉品包裝研發中心；其他化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

DYY-7C型電泳儀、DYCZ-24DN型電泳槽 北京六一儀器廠；UV-8100 B紫外-可見分光光度計 北京萊伯泰科儀器公司；TECAN Genios酶標儀 東勝創新生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 脫脂豆粕酶解液的制備

取10.0g過60目篩的粉碎豆粕，用水配制成質量濃度為10g/100mL的懸浮液，加熱至50℃后保溫50min，然后用1mol/L NaOH調至酶的最適pH值和溫度(堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶的最適pH值分別為8.0、6.0、8.0；最適溫度為50、40、37℃)，按酶與豆粕質量比為1：100比例分別加入蛋白酶，反應開始并計時。在整個反應過程中，滴加NaOH溶液維持酶反應液pH值恒定，并記錄消耗NaOH體積。反應到預定時間后，將反應液在沸水浴中加熱10min滅酶，冷卻至室溫后，2000r/min離心10min，上清液和沉淀部分分別冷凍干燥供分析用。

1.3.2 蛋白質的溶解性測定

采用雙縮脲法[13]測定可溶性蛋白質含量，蛋白質的溶解性按照下式計算。

1.3.3 SDS-PAGE分析

采用Laemmli系統進行SDS-PAGE分析[14]。電泳條件：5%濃縮膠，12%分離膠，初始電壓為80V，當電泳前沿進入分離膠時改用110V。采用低分子質量蛋白作標準，考馬斯亮藍R-250染色。酶解沉淀物樣品先用pH10 NaOH溶液提取再加還原樣品緩沖液進行電泳分析。

1.3.4 酶解物中大豆過敏原酶聯免疫分析(ELISA)[15]

樣品制備：可溶性酶解樣品用0.2mol/L pH7.4磷酸鹽緩沖液溶解并做梯度稀釋；水不溶性酶解樣品先用1mol/L NaOH提取1h，2000r/min離心10min，再用0.2mol/L、pH7.4 磷酸鹽緩沖液做梯度稀釋。

測定：將大豆過敏原酶聯免疫檢測試劑盒從冷藏環境中取出并在室溫平衡30min，稀釋標準品至質量濃度分別為12、6、3、1.5、0.75μg/mL。標準品孔加入標準品50μL、鏈霉親和素-HRP 50μL(標準品中已事先整合好生物素抗體，故不加)；待測樣品孔加入樣品40μL，然后加入抗大豆過敏原抗體10μL、鏈霉親和素-HRP 50μL；空白對照孔不加樣品，生物素標記的抗大豆過敏原抗體，鏈霉親和素-HRP(辣根過氧化物酶)，只加顯色劑A、B和終止液，其余各步操作相同，蓋上封板膜，輕輕振蕩混勻，37℃溫育60min后，揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30s后棄去，如此重復5次，拍干，然后每孔先加入顯色劑A 50μL，再加入顯色劑B 50μL，輕輕振蕩混勻，37℃避光顯色10min，最后，每孔加終止液50μL，終止反應。以空白孔調零，450nm波長依序測量各孔的OD值。測定在加終止液后10min以內進行。根據標準品的質量濃度及對應的OD450nm值計算出標準曲線的直線回歸方程為Y=0.0395X+0.1434(R2=0.9947)，式中，Y是OD450nm值，X是標準品質量濃度/(μg/mL)，再根據樣品的OD450nm值在回歸方程上計算出對應的樣品質量濃度。為便于比較，各部分具有抗原活性蛋白的含量均以原料豆粕質量為基數計算。

1.3.5 數據處理

采用Origin7.0軟件分析ELISA實驗結果。

2 結果與分析

2.1 不同酶對大豆蛋白溶解性的影響

圖 1 不同酶水解對大豆蛋白溶解性的影響Fig.1 Solubility of soybean protein during hydrolysis

由圖1可知，3種蛋白酶對大豆蛋白的酶解效果有一定差異。堿性蛋白酶酶解10min時，蛋白質的溶解性由未酶解時的62.30%快速增加到87.19%，木瓜蛋白酶酶解10min時增加到80.15%，而胰蛋白酶酶解10min時僅增加到72.74%。其后隨著酶解時間的延長，大豆蛋白溶解性雖然增加，但增加幅度均不顯著。至酶解120min時，3種大豆蛋白酶解物溶解性分別為96.10%、88.90%和80.00%。文獻[11]中用大豆分離蛋白(SPI)的研究結果也表明胰蛋白酶提高蛋白溶解性的效果不佳。

2.2 SDS-PAGE分析

2.2.1 可溶性酶解物的蛋白質亞基分析

為了解不同酶制劑對大豆抗原蛋白的降解過程，豆粕分別經堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶水解不同時間后，用SDS-PAGE方法分析了可溶性酶解物中的蛋白質亞基組成及其含量變化。

圖 2 3種蛋白酶水解物可溶性組分SDS-PAGE圖譜Fig.2 SDS-PAGE analysis of proteins in soluble hydrolysates

由圖2可知，經堿性蛋白酶水解10min后，抗原活性較高的大豆β-伴球蛋白(7S)的3個亞基(α’、α、β)已完全消失，11S球蛋白的38ku酸性亞基和21ku堿性亞基含量也明顯減少。酶解60min時，38ku亞基完全消失，酶解90min 時，21ku亞基也幾乎完全消失。同時，分子質量小于14ku組分的含量明顯增加。而整個酶解過程中，15ku堿性組分始終沒有被酶解的跡象。與堿性蛋白酶的效果相似，用木瓜蛋白酶水解10min后，7S伴球蛋白的亞基和11S球蛋白的酸性亞基幾乎完全消失，但繼續延長酶解時間，大豆蛋白的亞基組成和含量變化不大，說明木瓜蛋白酶可以在短時間內發揮酶解作用。胰蛋白酶對大豆蛋白的水解效果明顯不如堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶。在整個90min水解過程中，7S伴球蛋白的α’、α、β 3個亞基始終存在，僅僅是其含量有所減少；而11S球蛋白的酸性和堿性亞基的亞基組成及其含量幾乎無變化，說明胰蛋白酶對11S蛋白幾乎沒有作用。文獻[11]中對大豆分離蛋白的研究也表明，胰蛋白酶的作用效果較差，營養學研究也表明，動物消化道中的蛋白酶對大豆抗原蛋白的消化性不徹底，仍有部分抗原蛋白會進入血液[16-17]。本研究結果與文獻中的報道相吻合。

2.2.2 不溶性酶解物的蛋白質亞基分析

豆粕經酶解后，仍有少量蛋白質成分不能直接在水中溶解。為了全面、準確分析酶解對豆粕中大豆蛋白分子的影響，用SDS-PAGE法測定水不溶性酶解物蛋白質亞基組分。

由圖3可知，在未酶解豆粕中存在大豆脂肪氧化酶(97.40ku)，堿性蛋白酶水解10min時，大豆脂肪氧化酶、α’、α亞基和66.20ku的組分均已完全消失，11S中的酸性組分含量也大大減少，酶解60min時已全部消失。木瓜蛋白酶酶解物大部分組分分子質量在20.10ku以下，基本無大分子肽段。對于胰蛋白酶酶解物而言，酶解前后大部分組分無大的變化，大豆脂肪氧化酶(97.40ku)和66.20ku的組分隨酶解時間只有略微的減少，而23.00ku組分變化較明顯，酶解10min時大部分已消失。對比3種酶對不溶性酶解物的酶解效果，木瓜蛋白酶對大豆抗原蛋白有更明顯的降解效果，胰蛋白酶酶解效果最差。至于酶解物某些不溶性組分與可溶性組分具有相同分子質量的亞基而溶解性能不同，可能是它們的聚集狀態不一樣。用pH10.0氫氧化鈉溶液處理后改變了這種聚集才使其成為可進行電泳的溶解物。

圖 3 3種蛋白酶解物水不溶性組分SDS-PAGE圖譜Fig.3 SDS-PAGE analysis of proteins in insoluble hydrolysates (residues)

2.3 ELISA實驗

圖 4 水溶性(A)和不溶性(B)酶解物中抗原蛋白的ELISA結果Fig.4 Content of allergenic proteins in water soluble and insoluble hydrolysates determined by ELISA

由圖4可知，隨著酶解時間的延長，水溶性酶解物(圖4A)和不溶性酶解物(圖4B)中具有抗原活性的蛋白質(即過敏原)含量明顯降低?？梢钥闯?，在未酶解的每克原料豆粕中，抗原性蛋白的含量為195.90mg/g豆粕(其中在可溶性物中為136.50mg/g豆粕，不溶性物中為59.40mg/g豆粕)。用堿性蛋白酶水解10min后，可溶性和水不溶性豆粕酶解物中抗原蛋白含量只剩66.90mg/g豆粕和23.60mg/g豆粕；用木瓜蛋白酶水解10min后，兩部分酶解物中抗原蛋白的含量分別為75.60mg/g豆粕和18.70mg/g豆粕。兩種酶對豆粕抗原蛋白的去除率分別為53.58%和51.80%。隨著酶解時間的進行，酶解物中抗原蛋白含量降低的趨勢變緩，至反應120min時，堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶對豆粕抗原蛋白的去除率分別為75.70%和61.40%。而胰蛋白酶對大豆蛋白亞基和抗原性的降解效果相對較弱。這些ELISA實驗結果與SDS-PAGE中亞基組分的變化趨勢一致。

3 結 論

對酶解后大豆蛋白質分子亞基和抗原性的分析表明，3種蛋白酶的水解效果有明顯的差異。堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶的效果較好，酶解10min時，主要抗原蛋白的亞基已基本消失，抗原活性消除率超過50%。酶解120min時，兩種酶的抗原性去除率分別為75.70%和61.40%?？梢姡瑝A性蛋白酶和木瓜蛋白酶可有效消除豆粕的抗原活性，而胰蛋白酶的作用效果較差。這與蛋白酶的水解選擇性有關。

[1] WILSON S, BLASCHEK K, MEJIA E G. Allergenic proteins in soybean： processing and reduction of p34 allergenicity[J]. Nutrition Reviews, 2005, 63(2)： 47-58.

[2] KRISHNAN H B, KIM W S, JANG S C, et al. All three subunits of soybean β-conglycinin are potential food allergens[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2009, 57(3)： 938-943.

[3] 秦貴信, 孫澤威, 趙元, 等. 大豆中主要抗原蛋白的研究進展[J]. 吉林農業大學學報, 2008, 30(4)： 553-558; 564.

[4] AMIGO-BENAVENT M, CLEMENTE A, FERRANTI P, et al. Digestibility and immunoreactivity of soybean β-conglycinin and its deglycosylated form[J]. Food Chemistry, 2011, 129： 1598-1605.

[5] MARUYAMA N, KATSUBE T, WADA Y, et al. The roles of the N-linked glycans and extension regions of soybean β-conglycinin in folding, assembly and structural features[J]. Eur J Biochem, 1998, 258： 854-862.

[6] CHRISTENSEN H R, BRUUN S W, FR?EKI?R H. Antigenic specificity of serum antibodies in mice fed soy protein[J]. International Archives of Allergy and Immunology, 2003, 132(1)： 58-67.

[7] AALBERSE R C. Structural biology of allergens[J]. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2000, 106(2)： 228-238.

[8] SHREFFLER W G, BEYER K, CHU T T, et al. Microarray immunoassay： association of clinical history, in vitro IgE function, and heterogeneity of allergenic peanut epitopes[J]. J Allergy Clin Immunol, 2004, 113(4)： 776-782.

[9] TSUMURA K, SAITO T, KUGIMIYA W, et al. Selective proteolysis of the glycinin and beta-conglycinin fractions in a soy protein isolate by pepsin and papain with controlled pH and temperature[J]. Journal of Food Science, 2004, 69(5)： 363-367.

[10] 韓麗英, 范淑玲. 大豆分離蛋白中7S和11S大豆球蛋白的選擇性酶解研究[J]. 食品工業科技, 2008, 29(10)： 128-130.

[11] HOU Yao, ZHAO Xinhuai. Limited hydrolysis of two soybean protein products with trypsin or neutrase and the impacts on their solubility, gelation and fat absorption capacity[J]. Biotechnology, 2011, 10(2)： 190-196.

[12] SARA E, MOLINA O, JORGE R W. Hydrolysates of native and modified soy protein isolates： structural characteristics, solubility and foaming properties[J]. Food Research International, 2002, 35： 511-518.

[13] 張立娟, 姜瞻梅, 姚雪琳, 等. 雙縮脲法檢測大豆分離蛋白中蛋白質的研究[J]. 食品工業科技, 2008, 29(7)： 241-242.

[14] LAEMMLI U K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4[J]. Nature, 1970, 227： 680-685.

[15] LI Huijing, ZHU Kexue, ZHOU Huiming, et al. Effects of high hydrostatic pressure treatment on allergenicity and structural properties of soybean protein isolate for infant formula[J]. Food Chemistry, 2012, 132(2)： 808-814.

[16] LI Defa, NELSSEN J L, REDDY P G, et al. Transient hypersensitivity to soybean meal in the early weaned pig[J]. Journal of Animal Science, 1990, 68： 1790-1799.

[17] 孫澤威, 秦貴信, 婁玉杰. 大豆抗原及其對仔豬和犢牛的影響[J]. 動物營養學報, 2005, 17(1)： 20-24.