斑馬魚在轉基因動物研究中的應用

劉麗麗 王健 吳巍 王海勝 閆艷春

（中國農業科學院研究生院，北京 100081）

1981年美國俄勒岡大學著名遺傳學家George Streisinger在《Nature》雜志上發表關于斑馬魚人工雌核發育的研究論文，標志著斑馬魚開始進入實驗室模式生物研究領域，至今已有超過30年的歷史。20世紀90年代中國開始參與斑馬魚研究。近幾年，隨著斑馬魚模式生物南方中心、北方中心和國家種質資源庫相繼成立，中國斑馬魚研究也開始進入高速發展階段。由于體積小、代時短、胚胎透明、體外發育等特點，斑馬魚在模式生物研究中的地位越來越重要。隨著顯微注射、重組體構建以及熒光標記等技術的快速發展，轉基因斑馬魚已經廣泛用于脊椎動物基因表達調控、發育分化、形態發生、人類疾病、藥物篩選和環境檢測等研究領域。本文將就斑馬魚在轉基因動物研究中的應用進行介紹，并對該領域存在的問題進行總結。

1 常見模式生物

1.1 模式生物的發展歷史

模式生物（model organism）能夠代表一類生物的基本特點，結構相對簡單并易于進行試驗操作，因此普遍用于遺傳學、發育生物學、生理學和分子細胞學等方面的研究。其普遍特點是：首先，生理特征能夠代表生物界的某一大類群；其次，試驗材料容易獲得，并易于在實驗室內飼養、繁殖速度快，研究維持費用低；最后，容易進行試驗操作，特別是遺傳學分析［1］。一般認為模式生物的應用源于格里高·約翰·孟德爾（Gregor Johann Mendel）以豌豆為材料對遺傳學的研究。1866年孟德爾曾發表文章說他的試驗是“解決問題的唯一方法”。此后對模式生物的選擇遵循兩個方面的原則：一是該物種在系統進化中的地位符合研究目的，二是該物種特性適于特定研究的試驗需要［2］。在漫長的科學研究歷史中，各領域發展了多種模式生物，如大腸桿菌、釀酒酵母、秀麗隱桿線蟲、海膽、果蠅、擬南芥及小鼠等。模式生物的應用大大促進了基礎生命科學和實驗技術的發展。為闡明模式生物的遺傳背景，促進基因組研究，人類基因組計劃（HGP）最先提出模式生物基因組計劃，并初步確定了6種模式生物：大腸桿菌、酵母、線蟲、果蠅、擬南芥和小鼠。

1.2 模式生物的各自特點及應用領域

自從萊德伯格（Joshua Lederberg）應用大腸桿菌（Escherichia coli，E. coli）進行遺傳學研究以來［3］，大腸桿菌迅速成為廣泛應用的原核模式生物。它具有遺傳背景清楚、操作技術簡便、成本低、易于大規模培養等特點和優點，而且還特別適合作為外源基因表達的宿主。因此，大腸桿菌是目前應用最廣泛、最成功的克隆原核基因的表達體系。釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作為最簡單的低等單細胞真核生物之一，是研究細胞周期、胚胎形態發生、染色體穩定性和衰老的優秀模型，哈特維爾（Leeland H. Hartwell）和納斯（P. M. Nurse）以釀酒酵母為材料，為揭示細胞周期的調控機理作出了重要貢獻。前者提出了細胞周期關卡（cell-cycle checkpoint）的概念，并確定了大量的控制細胞周期的基因（cdc），后者從粟酒酵母（S. pombe）中分離到第一個基因cdc2，并提出來相關的調控體系［4］。秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）結構非常簡單，一條雌雄同體的秀麗隱桿線蟲只有不超過1 000個細胞，遵循特定的分裂模式。同時，它還具有多細胞生物的基本特征，如復雜的器官系統（complex organ system）、社會行為、性行為和學習行為等，為傳染性疾病［5］和多種人類疾病［6］的研究提供模型。許多生物進化的保守機制都是通過秀麗隱桿線蟲闡明的，包括程序性細胞死亡（programmed cell death）［7］、胰島素信號［8］、衰老［9］和神經生物學（neurobiology）［10］，也使自然免疫和RNA干擾（RNAi）機制的研究取得了巨大進展［11］。20世紀70-80年代，基于對果蠅（Drosophila melanogaster）的研究工作，興起了胚胎學和分子生物學，從此果蠅成為遺傳學研究最重要的材料之一。試驗中分離鑒定到大量的果蠅突變體，促進了動物發育學和疾病的研究。擬南芥（Arabidopsis thaliana）是植物界最重要的模式生物，在研究器官發育、植物干細胞生 物 學［12］、圖 式 形 成（pattern formation）［13］、先天免疫（innate immunity）［14］、晝夜節律（circadian rhythm）［15］、各種性征的自然突變［16］以及諸多發育機制中都取得了重要的進展。由于與人類的近親關系，小鼠（Musmusculus）是人類基因組研究最主要的模式生物之一，也是哺乳動物研究領域最重要的模式生物，廣泛用于發育學、分子生物學、分子遺傳學、免疫學和生物醫學等研究領域［17］。小鼠為人類疾病的研究，包括癌癥、動脈粥樣硬化、高血壓、糖尿病、骨質疏松和青光眼等作出巨大貢獻。同時，基因組的靶標操作［18］、正向遺傳突變篩選［19］和體外成像技術［20］的高速發展也使小鼠成為干細胞研究的主要模式生物之一。

2 斑馬魚作為模式生物的優越性

作為模式生物，斑馬魚（Danio rerio）不僅有脊椎生物的一般特點，而且具備諸多技術優勢：飼養簡單、成本較低、繁殖力強、胚胎透明、個體較小、時代時間短、遺傳信息豐富、擁有大量實驗室突變系、可進行正向和反向遺傳分析等［21，22］。

斑馬魚個體較小，可以在較小的空間里繁殖高密度的種群，利于節省試驗成本。時代時間較短，僅3-4個月，有助于長期的遺傳學研究。實驗室條件下，斑馬魚可常年產卵，允許連續大規模繁殖后代。通常，雌性每周可產卵一次，每次產卵50-200枚。胚胎發育快，受精后24 h（hpf）身體成型，大部分器官96 hpf內發育完全。斑馬魚胚胎個體小，可在微孔反應板上培養；與哺乳動物胚胎在子宮內發育的情況不同，斑馬魚是體外發育（圖 1），便于人工操作，如通過控制培養液直接對胚胎進行水處理（water treatment）；胚胎透明度高，且發育快速，易于觀察，適于進行顯微注射。斑馬魚全基因組測序已于2005年完成（http：//zebrafish.org/zirc/home/guide.php），豐富的遺傳信息為確定斑馬魚各種生物學參數的標準值、鑒定試驗突變體提供了依據。基于實驗室研究的迅速發展，現已獲得多種具有不同特性的斑馬魚突變品系，能滿足不同試驗需求［23］。

圖1 斑馬魚體外受精

豐富的遺傳信息、充足的突變體材料和多種技術優勢使斑馬魚成為脊椎生物發育學、遺傳學、生態學、基礎生物醫藥學、毒理學等多個領域的優秀模式生物。（1）斑馬魚體外受精，胚胎透明度高，可活體觀察表型變化，進行表型篩選 。（2）高度的光學透明性也允許在保持胚胎完整的條件下，甚至活體條件下，對相關基因的時空表達模式進行觀察分析。如通過整體胚胎原位雜交技術檢測基因轉錄產物的表達［24］，或通過免疫組化技術檢測基因翻譯產物的表達，其他技術如RT-PCR、免疫共沉淀也可用于斑馬魚基因表達信息研究［25］。（3）后代數目大、胚胎體積小、發育快，允許斑馬魚用于高通量篩選，而且許多人類疾病在胚胎早期即表現病變性狀［26］，其在表形篩選方面的獨特優勢使斑馬魚成為發現新藥的有效藥理學工具［27］。（4）斑馬魚還用于研究傳染性和遺傳性人類疾病的研究，如分歧桿菌病［28］和神經性疾病［29］。（5）可利用斑馬魚進行正向遺傳篩選發現疾病中基因的新功能。斑馬魚是迄今為止唯一能進行大規模正向遺傳篩選的脊椎動物［30］。（6）斑馬魚也是常用的脊椎動物毒理學模型，用作生態毒理學測試物種，檢測水質中化學物質對魚類生存、生長和繁殖狀況的影響。但基于動物權益維護和環境保護的需要，目前斑馬魚胚胎毒理學測試僅作為備用手段用于減少或代替實時監測 。

但實驗室養殖斑馬魚也有困難，該種群易發生微孢子蟲病和分枝桿菌病，這兩種難治愈且不易根除的傳染性疾病［31］。此外，斑馬魚生物學和生態學的信息還十分有限［32］，基因組數據庫也不完善，不能滿足當前研究的需要。目前斑馬魚的反向遺傳學手段應用較少，使用特殊設計并合成的嗎啉代寡聚核糖核酸（morpholino）可以暫時性的抑制目的基因的表達。

3 斑馬魚轉基因技術的發展現狀

20世紀80年代，中國科學院朱作言領導的實驗室在世界上率先開展了魚類基因工程定向育種研究，建立了完整的轉基因魚理論模型和完善的試驗技術體系，為轉基因魚育種奠定了理論基礎［33］。30年來，斑馬魚轉基因技術的迅速發展為斑馬魚基礎理論研究和實際應用奠定了基礎。目前，實驗室有幾種技術成功用于斑馬魚轉基因研究。

3.1 顯微注射技術

斑馬魚胚胎顯微注射技術是進行基因瞬時表達、過量表達、降低表達、制備轉基因斑馬魚或誘發突變的重要手段，該方法操作相對簡單、效果可靠，是斑馬魚轉基因研究的主要方法，獲得轉基因斑馬魚種系的頻率為10%-30%［34］。一般認為，質粒DNA注射到受精卵細胞質后立即形成大分子量多聯體（concatemers），并可能參與基因重組［35］。但是外源基因的多聯體整合，容易為染色體內重組提供條件，最終可能導致外源基因表達的改變。

3.2 GAL4/UAS系統和Tol2轉座子

顯微注射技術通常使用含標記蛋白的質粒載體（如pEGFP-N1），現在一些其他類型的載體也用于斑馬魚轉基因研究。GAL4/UAS轉錄激活系統可以同時表達兩個外源基因，以提高其在宿主細胞中表達水平［36］，并越來越多的用于斑馬魚基因調控和轉錄沉默機制的研究。通常斑馬魚中使用的Tol2轉座子去除了內部原有的轉座酶編碼區域并用EGFP基因序列代替，注射時將其與轉座酶一起轉到斑馬魚受精卵中，轉座酶以一定幾率完整切割轉座元件，這些轉座元件隨之整合到斑馬魚基因組中。有學者將Gal4/UAS與Tol2元件聯合使用，成功實現了斑馬魚基因組水平上的插入表達［37］。

3.3 擬型反轉錄病毒和桿狀病毒介導法

擬型反轉錄病毒也已經成功用于斑馬魚研究，它的插入效率比Tol2轉座子更高，而且與顯微注射相比，使用該方法得到的轉基因奠基者（transgenic founder）之間表達范圍的差異性比較小。盡管如此，由于逆轉錄病毒轉基因技術所需的構建、包裝、效價評定和轉染耗時較長，因此該技術不能用于常規轉基因斑馬魚的構建和啟動子及基因功能的分析［38］。重組桿狀病毒介導法是一種更新的方法。桿狀病毒可以高效地轉導哺乳動物細胞，Huang等［39］對桿狀病毒加以改進：使用巨細胞病毒早早期啟動子（CMV-IE），以加強型綠色熒光蛋白（EGFP）作報告基因。結果發現重組桿狀病毒可以將外源基因高效地導入已分化的魚類細胞，轉基因細胞培養15 d內熒光持續較高亮度，繼續培養一段時間可觀察到熒光細胞的數目并未減少。

3.4 熒光標記

圖2 轉基因斑馬魚（5 dpf，受精后5 d）在激發光下表達熒光

隨著綠色熒光蛋白（GFP）的發現及其晶體結構的破解，GFP越來越多地作為報告基因用于轉基因研究。除野生型GFP外，現已發展了3種突變體，EGFP、GFP-S65T和RS-GFP［40］。GFP作為報告基因無需底物，現象明顯易于觀察，反應更敏感，成為轉基因斑馬魚報告基因的理想選擇（圖2）。2003年，新加坡國立大學宮之遠教授成功將綠色、紅色、黃色和橙色熒光蛋白與肌肉特異性mylz-2啟動子融合，成功構建了在骨骼肌高度表達熒光蛋白的各色轉基因斑馬魚品系，日光和紫外燈下都可以肉眼觀察到轉基因斑馬魚發出熒光［41］。

4 轉基因斑馬魚的應用前景

由于胚胎體積小、透明度高、發育快等特點，斑馬魚成為研究脊椎動物基因表達調控和發育分化、形態發生、人類疾病、藥物篩選和環境檢測等領域最重要的模式生物之一。

4.1 轉基因斑馬魚用于基因表達和發育調控研究

以斑馬魚為模式生物，利用轉基因技術，科學家們對脊椎動物熱生物學進行了系統的研究，包括溫度對斑馬魚生長發育、繁殖和性別分化的影響，溫度對生理節律、動物行為的調節，溫度對基因表達（如熱激蛋白）的影響等。此外，對生物鐘系統、細胞周期、神經發育學都有廣泛的研究。孟安明，林碩［42］利用斑馬魚GATA-2基因5'側翼調控序列和GFP基因，獲得了只在中樞神經細胞表達GFP或在神經細胞和表層細胞都表達GFP的轉基因斑馬魚種系，同時還進一步證實了GATA-2基因在胚胎發育中的時空表達譜。

4.2 活體形態發生和細胞遷移研究

為觀察胰外分泌腺細胞的分化、增殖和形態發生，用彈性蛋白酶A啟動子調控GFP在斑馬魚胰腺外分泌腺中特異性表達，發現胰腺在發育早期是一個緊密結合的實體，然后沿腸向后延伸［43］。Kawakami等［44］將GFP融合斑馬魚nanos1基因3' UTR，合成RNA后注射到幾種硬骨魚體內，成功觀察到原生殖細胞向生殖脊遷移，但是這種方法目前并不能適用于所有硬骨魚類。

4.3 人類免疫性疾病、自體吞噬和神經性疾病的研究

斑馬魚遺傳操作簡單，已經成功用于多種人類疾病模型的構建，在研究人類疾病發病機理、治療手段等方面作出了卓越貢獻。例如，通過斑馬魚啟動子表達顯性突變基因，構建熒光重組體，瞬時過表達和反義基因敲除技術的應用，對人類中央核性疾病、亨廷頓舞蹈癥、多谷氨酰胺疾病和老年癡呆癥等多種疾病進行了深入研究［45］。

4.4 熒光魚篩查突變體、阻斷特殊發育途徑的小分子或抑制正常發育的毒素

Wan等［43］將elaA：gfp轉入猥因子接受缺陷型斑馬魚突變體slow muscle omitted，發現猥因子為外分泌腺形態發生所必需，但不影響細胞分化。對該轉基因品系進行嗎菲林基因敲除和毒劑介導的細胞切除，發現胰腺外分泌腺發育依賴Islet-1基因。注射elaA啟動子驅動的白喉毒素DTA導致外分泌細胞選擇性消融，但內分泌腺和其他內胚層發育來的器官不受影響。該研究成功揭示了猥因子和白喉毒素對胰腺正常發育的重要影響。基因熒光標記魚類與反求遺傳學方法聯合起來可以分析在特殊的發育途徑中已知基因的作用規律。

4.5 轉基因斑馬魚用于生態環境監測

近年來，國內外運用轉基因斑馬魚檢測水體環境中的重金屬毒性、環境激素、綜合毒性和有機污染物毒性等，成效顯著，日益受到關注。目前主要通過3種途徑使用轉基因斑馬魚對環境污染物進行監測［46］。第一種方法是使用整合了大量大腸桿菌穿梭載體的轉基因斑馬魚檢測環境誘變劑，如以熒光定位的轉換來測試誘變劑的活性；第二種方法是使用受到不同環境污染物，如芳烴、重金屬或環境雌激素污染影響的啟動調控元件，利用該元件誘導熒光或熒光酶的表達；第三種方法是利用組織特異性表達的熒光魚篩選隨特殊發育途徑產生特殊作用的環境毒素。

在受熱、重金屬等壓力脅迫條件下，生物體細胞中的熱激蛋白HSP會在保護和修復途徑中發揮重要作用。Seok等［47］利用斑馬魚轉基因技術研究硫酸銅對人類HSP70啟動子的特異性激活，表明斑馬魚可以作為轉基因生物傳感器檢測環境中的異生毒性物質。紀喜文等［48］構建了一種GFP 轉基因斑馬魚報告系統。利用芳香烴反應元件AHRDtk 控制報告基因綠色熒光蛋白在斑馬魚體內的表達，通過顯微鏡觀察轉基因斑馬魚體內的綠色熒光表達情況，可以直觀判斷水環境中是否含有該類化學物質。上海復旦大學的研究人員［49］經過多年研究，成功構建了卵黃蛋白原1（vtg1）啟動子調控綠色熒光蛋白表達的轉基因斑馬魚品系，可以簡便直觀快速地監測環境中的雌激素類物質，如β-雌二醇（E2）、氯化鎘（CdCl2）、玉米烯酮和雌三醇（E3）等。

5 斑馬魚轉基因技術待解決的問題

由于斑馬魚基因組為二倍體，目前鑒定到的許多同源基因，尚不能確定是真正的同源基因還是由于注釋不完整而對同一基因的不同解釋，所以斑馬魚數據庫亟待完善。斑馬魚轉基因技術最主要的問題仍然是基因轉化效率問題。目前最可靠、最普遍的方法是顯微注射，該方法對操作人員的技術水平要求很高，在操作精確的條件下，轉化率最高也僅維持在30%左右。另一個問題是嵌合體問題。由于基因整合的隨機性和多樣性，轉基因魚親本是攜帶外源基因的嵌合體，外源基因在各個性腺細胞基因組內的整合的數量與位點不盡相同，由此導致子代群體在攜帶外源基因（包括數量和整合位點）上出現分離［33］。其他問題包括因使用其他物種的啟動子序列可能導致的轉基因沉默，外源基因整合位點的隨機性，外源基因整合形成多聯體等。

綜上所述，斑馬魚因具有體積小、代時短、胚胎透明、體外發育等獨特的優勢，使之成為轉基因動物研究領域最重要的模式生物之一，在研究基因表達、發育調控、形態發生、細胞遷移、人類疾病、發育毒素、環境監測、藥物篩選等領域作出巨大貢獻。作為新型模式生物，轉基因斑馬魚在各領域得到廣泛應用的同時，其理論研究和操作技術都亟待發展：外源基因在斑馬魚胚胎細胞內的重組機制尚不明確；基因轉化效率有待提高；轉基因斑馬魚體系的代系維持需要加強，同時還需要尋找更加高效靈敏的報告基因。隨著研究理論和技術手段的日趨成熟，模式生物斑馬魚研究將引起更多關注并在更多的科學研究中發揮重要作用。

致謝：感謝中國科學院遺傳與發育生物學研究所吳乃虎研究員在本文寫作過程中給予指導和修正；感謝北京大學生命科學院張博實驗室在試驗研究過程中給予大力支持與幫助。

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