蛋白片段互補分析方法及其應用

張潔 柳長柏

（三峽大學分子生物學研究所，宜昌 443002）

蛋白質是生命體的重要組成成分，是細胞活性及功能的最終執行者。蛋白質之間復雜的相互作用決定著生物體的復雜程度。不同細胞在不同生理或病理狀態下所表達的蛋白質及其功能也不盡相同，因此對蛋白質結構定位及蛋白質之間相互作用的研究將為闡明生命現象的本質提供直接的依據，也可為疾病治療提供潛在靶點。

迄今，研究蛋白質相互作用的方法主要有酵母雙雜交技術、熒光共振能量轉移技術及雙分子熒光互補技術等。新近發展起來的蛋白質片段互補分析（protein fragment complementation assay，PCA）技術因為可以在體內外動態地研究蛋白質相互作用而日趨引人注目。PCA是一種高靈敏度，可定量化的，高通量篩選方法，可動態地觀察活細胞、器官、甚至個體水平蛋白相互作用，被廣泛地應用到藥物遞送，化學遺傳學，蛋白質組學等研究領域［1，2］。

1 PCA原理

所謂PCA是指將某個功能蛋白切成兩段（如N端和C端），分別與另外兩種目標蛋白相連形成兩個融合蛋白。在一個反應體系中，兩個目標蛋白的相互作用使得兩個功能蛋白質片段相互靠近，互補并重建功能蛋白質的活性，通過檢測功能蛋白質的活性來判斷目標蛋白質間的相互作用。在PCA體系中，功能蛋白的兩個片段可以互補融合成報告蛋白（如酶、熒光蛋白等）。只有兩個目標蛋白發生了相互作用，才能使報告蛋白的兩個片段相互靠近，重新折疊恢復其天然結構，重構生物活性。圖1以熒光蛋白為例說明PCA原理。X、Y和Z為研究目標蛋白，N、C為由報告蛋白的熒光蛋白切割形成的N端和C端片段。（1）目標蛋白X通過連接子與N片段相連，目標蛋白Y通過連接子與C片段相連。如果X和Y不發生相互作用，則熒光蛋白不能重新折疊、重構熒光生物活性；（2）目標蛋白X和Z可發生相互作用，使N片段和C片段重新折疊重構熒光蛋白生物活性。

圖1 PCA原理示意圖

2 PCA報告蛋白的選擇

PCA方法的特征是報告蛋白的互補片段不能自發折疊，只有在目標蛋白發生相互作用后，才促使報告蛋白再折疊恢復生物活性。自發折疊將會導致假陽性信號。報告蛋白互補片段的融合會影響互相作用的蛋白以及檢測其相互作用的能力。因此，第一，對于任何一個報告蛋白來說，要確保最佳位點切割不會損害其功能，可通過再折疊形成有功能的融合蛋白；第二，需考慮報告蛋白的定位或者互補片段的鑒定是否影響PCA試驗結果［3］。

目前PCA所使用的報告蛋白包括二氫葉酸還原酶［4］（DHFR），β-內酰胺酶［5］（β-lactamase），綠色熒光蛋白（GFP），熒光素酶Gaussia luciferases［6］、Renilla luciferases［7］及Cre重組酶［8］等。其結構分為兩部分，單獨表達時均無活性，可通過試驗檢測到最佳切割位點，通過連接子（soft linker）與目標蛋白連接。Remy等［3］在目標蛋白和報告蛋白片段之間使用連接子（Gly.Gly.Gly.Gly.Ser）n發現，該連接子具有很好的靈活性，能有效地使互補片段折疊復性而不影響各個蛋白（片段）的相互作用。

2.1 基于DHFR的PCA

DHFR在真核細胞核苷酸生物合成中起重要作用，催化二氫葉酸還原成四氫葉酸，細胞缺失DHFR是致死性的，而成為極佳報告蛋白應用于PCA研究。Remy等［9］研究發現，DHFR-PCA有兩個層面的檢測方法：（1）利用DHFR對細胞生存是必須的特征，通過觀察細胞的生長狀態來間接反映出兩種目標蛋白有無相互作用。其缺點是不能反映出目標蛋白是何時發生作用，作用部位等動態過程；（2）熒光標記的底物甲氨蝶呤只能與完整的DHFR作用才能產生熒光，因而可以動態地反應目標蛋白相互作用發生的時間、位置等。

2.2 基于β-lactamase的PCA

β-內酰胺酶是細菌產生的以β-內酰胺類藥物為底物的水解酶。Galarneau等［5］使用TEM-1型 β-lactamase建立了PCA，該亞型缺乏由23個氨基酸組成的胞質分泌信號序列，不能分泌到胞質中。TEM-1型 β-lactamase在真核生物中沒有同源體，對細胞沒有毒性，故而β-lactamase-PCA被普遍用于在真核細胞和沒有本底表達的大部分真核生物個體中的蛋白相互作用研究。

β-lactamase-PCA檢測方法包括：第一，以頭孢菌素類的衍生物頭孢硝噻吩（nitrocefin）為底物，用細胞裂解液進行比色測定，當底物發生水解時，顏色會由黃色變成紅色。由于nitrocefin不能透過細胞膜，故只能檢測細胞裂解液中的蛋白相互作用；第二，用完整的細胞進行熒光分析，以CCF2/AM為熒光底物，當CCF2/AM進入細胞膜，在胞內酯酶的作用下釋放內酰胺酶的底物CCF2。CCF2能夠被雙重激發，在409 nm波長激發光下將能量傳遞給受體發色基團，在520 nm波長處發綠色熒光。而當CCF2在β-內酰胺酶作用下水解則使2個發色基團分開。在相同激發光下，因發色基團離受體較遠（>10 nm），供受體之間不能發生熒光能量共振，只能于477 nm波長處發出供體自身的藍色熒光。檢測細胞內熒光定量，或運用熒光顯微鏡通過觀察細胞內因底物降解而發生藍色熒光及其定位來判斷β-內酰胺酶的兩個片段是否因目標蛋白相互作用而互補，恢復了完整的β-內酰胺酶活性。

2.3 基于熒光蛋白的PCA

綠色熒光蛋白及其變種由于不需要任何底物或者輔助因子就可以產生熒光，被廣泛用作PCA的報告蛋白，通過熒光顯微鏡、流式細胞術、光譜法等可用GFP-PCA，YFP-PCA觀察蛋白之間的相互作用，活細胞內蛋白復合體的形成，還可應用到細胞cDNA文庫的篩選等［10］。但是與具有酶活性的報告蛋白相比，基于熒光蛋白的PCA不適合進行定量化和動態研究，僅能作為定性研究。

2.4 基于熒光素酶的PCA

分泌型熒光素酶（Gaussia luciferase，Gluc）和花蟲型熒光素酶（Renilla luciferases，Rluc）均是從海洋發光生物體中分離出來的熒光素酶。Gluc是由185個、Rluc是由312個氨基酸殘基組成的蛋白質分子，在有氧環境中，作用于底物腔腸素，在480 nm波長激發光下發藍色熒光。Gluc是一種分泌性蛋白酶，可以檢測培養細胞上清，或實驗動物體液，對酶活性進行定量分析。

Michnick［11］于人源化Gluc第93位氨基酸進行剪切形成2個片段，通過連接子連接目標蛋白，分析了TGF-β信號通路中一些分子之間的相互作用，以及藥物處理對相關信號分子間相互作用的影響。Stefan等［7］成功地運用Rluc-PCA技術研究了蛋白激酶A在G蛋白偶聯受體介導的信號通路中的作用及藥物處理對信號轉導影響的定量分析。Gehl等［12］利用浮葉熒光素酶為報告蛋白的PCA方法實時定量分析了鉬元素輔因子生物合成蛋白CNX6和CNX7，實現了實時定量監測蛋白復合體的組裝。

2.5 基于Cre重組酶的PCA

Cre重組酶存在于大腸桿菌噬菌體P1中，由343個氨基酸組成DNA重組酶，可識別Loxp位點等特異性序列而引起DNA重組。研究表明，切割后的Cre重組酶片段允許其兩個啟動子調控DNA重組。

Hirrlinger等［8］設 計 了Cre-ERT2-PCA方 法，ERT2是人雌二醇受體，Cre-ERT2是將Cre融合到ERT2配體結構域。Cre-ERT2對他莫昔芬及其代謝產物4-羥泰米芬（4-OHT）有高度敏感性，在缺乏誘導劑他莫昔芬時，融合蛋白將被熱激蛋白綁定，在細胞漿中無法進入胞核。而加入他莫昔芬時，Cre-ERT2將從復合體中釋放出來，進入細胞核切除LoxP位點之間的序列。研究結果表明，該方法適用于包含Loxp等位基因的模型小鼠誘導DNA重組。

3 PCA的應用

3.1 篩選相互作用的蛋白質文庫

Galarneau等［10］證實β-lactamase-PCA提供了一種篩選蛋白相互作用的模型，該模型對于信號和本底表達的比例可達到10∶1到250∶1，較其他的PCA效果靈敏。該方法具有一定的廣泛性，作者檢測了一些已知的蛋白相互作用，包括同型二聚體的亮氨酸拉鏈模型，Bad和Bcl2，PKB以及底物Bad。研究表明，β-lactamase PCA允許檢測蛋白之間相互作用，因為沒有近似的本底表達導致酶的自發折疊。

具有簡單性、靈敏性和穩固性的體外β-lactamase PCA提供了一種大規模分析蛋白相互作用的有用的方法。而熒光共振能量轉移策略可以提供相同的信息，但是在大規模應用中需要小心地檢測熒光染料標記的蛋白表達水平；β-半乳糖苷酶亞基互補策略分析有自發亞基組合導致有本底表達的干擾。

3.2 cDNA文庫篩選

PCA方法是一種高通量的蛋白質文庫篩選方法，該方法依賴于細胞依賴性蛋白的特殊功能的篩選。首先是獵物蛋白和誘餌蛋白自然發生的相互作用，通過在活細胞內監測PCA報告蛋白的再折疊。篩選的重要的特點是相互作用可以直接被檢測到，同時PCA片段不會干擾蛋白的靶向作用和修飾作用。繼而通過PCA檢測到的蛋白相互作用能被代理劑擾亂，如激素類或特殊的抑制劑［10］。

GFP-PCA可以檢測蛋白相互作用的亞細胞定位，信號通路中的代理劑的影響。因此，依賴于PCA的篩選策略都會和一些直接的功能分析相結合。研究者應用這一策略來鑒定絲/蘇氨酸蛋白激酶PKB/Akt的新型的底物和調節物。該方法提供了鑒定和確證任何細胞過程中蛋白的作用，識別酶的底物和調節蛋白［11］。

3.3 繪制生物化學網絡

生物化學的網絡圖可以通過研究活細胞內的蛋白和蛋白之間動態的研究來繪制。通過PCA這種方法可以繪制動態圖以及鑒定在這個網絡中可能出現的新的起某種作用的元件。該方法比傳統的靶向藥物治療提高了準確度。

Michnick等［13］利用DHFR-PCA繪制了酪氨酸激酶受體介導的信號轉導途徑發現，RTK信號通路網絡與現有模型一致，同時還發現一些新型的相互作用（35個全長蛋白中有14個有效，其中有5個是新發現的）。結果表明PCA策略可以完成一般基因功能的確認及通路圖的繪制，同時可以監測信號通路中蛋白質的一些潛在的反應。該方法的一個大規模的應用是連接一個特殊的藥物在特異性的信號通路途徑中，監測藥物的作用。Remy等［14］設計的GFP-PCA的方法可以探測完整的活細胞內蛋白的相互作用，不僅可以動態研究蛋白的相互作用，而且可以研究在物理或者化學因子作用下的微干擾，并設計了Gluc-PCA監測TGF-β信號通路中Smad和PKB的表達情況。Michnick［15］使用YFP-PCA方法研究MAP激酶介導的信號通路，繪制該通路中影響因子，繼而篩選一些藥物和治療靶點。Manderson等［16］用依賴于熒光素酶的PCA發現一種新的絲/蘇氨酸激酶ElmI在酵母轉錄因子SBF的失活中起很重要的作用。Stefan［7］使用Rluc-PCA定量研究了G蛋白偶聯受體通路中的一些藥物處理后的影響，繪制相關作用網絡，應用于藥物篩選。

3.4 配受體相互作用及潛在治療

配受體相互作用促進胞內信號轉導，治療因素靶向細胞表面受體繼而與配體結合。著重強調研究配受體復合體在完整的細胞內和活體動物中完成對正常的信號通路中疾病，藥物作用等方面的研究。目前主要用的是熒光或放射性配體。發展成像分析在生理條件下定量檢測配受體復合體促進了對疾病和加快藥物遞送的研究進展。

Luker等［17］使用熒光素酶蛋白片段互補分析定量的檢測趨化因子配體12（CXCL12）和趨化因子受體4，7（CXCR4，7）綁定情況。研究表明：小分子抑制劑CXCR4和CXCR7可以特異性的阻滯CXCL12在細胞內的結合，同時顯示不同的趨化因子抑制劑在與受體結合時動力學的不同。在小鼠乳腺癌模型生物發光成像技術展示了CXCL12-CXCR7結合發生在轉移性腫瘤中。Gluc-PCA可以定量的分析藥物的靶向作用，允許實時定量的分析受體的靶向性，其生成物在腫瘤生長和轉移時效應。且該成像系統可以應用于任何配受體結合的分析。

3.5 發現新型藥物及高通量篩選藥物

G蛋白偶聯受體超家族是很重要的一類制藥靶點，用以研發新型藥物，而激動劑誘導的第二信使以及下游的蛋白激酶A（PKA）是信號通路中的關鍵影響因子。

Stefan等［6］設計了Rluc-PCA研究發現相關信號通路中的特異性藥物。該方法可以實時定量的研究某一特異的激動劑及拮抗劑對于細胞或小鼠的影響。L?fdahl等［18］用β-lactamase篩 選 與TNF-α結合的親合體分子，用于高通量篩選藥物治療腫瘤。Hashimoto等［19］以單體的香菇珊瑚來源的綠色熒光蛋白（mKG）為報告基因，在試管內使用PCA方法高通量篩選蛋白相互作用抑制劑，完成了高通量篩選藥物。研究表明，在TCF7/β-catenin，PAC1/PAC2，PAC3同源二聚體之間的相互作用的抑制劑中，氨硫脲（TB1）只是PAC3同源二聚體的抑制劑。

4 小結

PCA技術是近幾年研究蛋白相互作用的重要策略之一，具有高靈敏性，可逆性，高通量篩選等一系列的優勢，同時報告蛋白提供了明確可行的檢測手段，包括熒光顯微鏡，酶和底物顯色反應。PCA可實時定量動態的反映出蛋白復合體的組裝與解離過程，應用于體內外的試驗，且克服了雙分子熒光互補技術中熒光片段的自發互補及其不可逆性。而熒光共振能量轉移技術及生物發光能量共振轉移對供體的發射光譜和受體激發光譜有一定的要求，因此需要更精密的儀器，且操作復雜［20，21］。

PCA技術在高通量藥物篩選方面的應用是目前關注的焦點，提高了藥物治療的靶向性，為研發新藥奠定了基礎。但是PCA互補片段如何重新組合并部分恢復其功能的結構基礎還不是很清楚，這其中涉及到蛋白的折疊和兩個肽段之間精細的相互作用。如果在以后的研究中克服因信號放大產生的假陽性結果，以及外源蛋白過量表達對細胞產生毒害，PCA將會在生命科學及醫藥研究領域中得到更廣泛的應用。

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