D-氨基酸檢測方法研究進(jìn)展

李輝欣 鞠建松 張琳琳 徐書景

（河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，石家莊 050024）

一直以來，人們認(rèn)為D-氨基酸只在細(xì)菌細(xì)胞壁的組成中起重要作用，但最近的一些分析技術(shù)研究表明，在真核生物中也存在著一些高濃度的D-氨基酸，如D-絲氨酸、D-天冬氨酸等。這些氨基酸在生物體內(nèi)也發(fā)揮著重要的生理作用［1，2］，研究發(fā)現(xiàn)，在哺乳動物中D-絲氨酸與記憶和學(xué)習(xí)有關(guān)［3］，D-天冬氨酸與激素分泌功能有關(guān)［4］，而在垂體前葉，胰腺和血漿中D-丙氨酸濃度的波動與激素調(diào)節(jié)有關(guān)［5］。一些D-氨基酸的存在與某些疾病有關(guān)，研究人員發(fā)現(xiàn)，在精神分裂癥患者的血清和脊髓液中D-絲氨酸的濃度較低［6］，而在肌萎縮性側(cè)索硬化癥患者的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中其濃度較高［7］。此外，精子畸形患者精漿和精子中D-天門冬氨酸的濃度比正常人低［8］。

食品中D-氨基酸的濃度常取決于原材料中初始D-氨基酸的含量。D-丙氨酸，D-谷氨酸，D-天冬氨酸，D-絲氨酸，D-脯氨酸，D-苯丙氨酸，D-精氨酸和D-亮氨酸等已被認(rèn)定為各種食物中的天然成分，在發(fā)酵產(chǎn)品中我們也可以檢測到D-氨基酸，它們是在天然加工過程中產(chǎn)生的（D-丙氨酸、D-谷氨酰胺、D-天冬氨酸存在于奶酪、酸奶、酒和醋等中）［9，11］。另外，在食物中D-氨基酸的出現(xiàn)通常與蛋白的消化下降有關(guān)，從而影響必需氨基酸的生物利用度，也就是最終影響食物的營養(yǎng)價值［9］。因此，D-氨基酸的濃度與D/（D+L）的比率可以作為評價食物質(zhì)量的指標(biāo)（識別食物是否摻假）和成熟的分子標(biāo)記。然而，D-氨基酸的含量也與細(xì)菌感染有關(guān)。細(xì)菌細(xì)胞壁中含有肽聚糖和多糖交聯(lián)形成的多肽，其中D-丙氨酸是主要的成分；其次是D-谷氨酸。因此，D-丙氨酸和D-谷氨酸含量可以作為食物是否受到細(xì)菌污染的標(biāo)志［10］：當(dāng)果汁被細(xì)菌感染時可以檢測到大量的游離的D-丙氨酸，牛奶在4℃放置1 h后游離的D-丙氨酸急劇增長［11］。除了這些特定的例子之外，所有氨基酸的D-型同分異構(gòu)體還可以作為食物中摻假的推論依據(jù)：添加水解蛋白來掩飾低的營養(yǎng)成分或不合理的工藝流程都會導(dǎo)致D-氨基酸含量增加，而在一些嬰幼兒奶粉中發(fā)現(xiàn)大量D-天冬氨酸就是由于L-型同分異構(gòu)體在高溫噴霧干燥或滅菌時經(jīng)外消旋產(chǎn)生的［11］。

有鑒于此，必須建立快捷而精確的D-氨基酸檢測方法。本文主要介紹幾種主要的用于檢測D-氨基酸的方法。

1 D-氨基酸檢測方法

1.1 酶法

酶法是一種簡單、實用的分析方法，由于酶的活性中心是不對稱環(huán)境，有利于識別消旋體。在一定條件下，酶只能催化消旋體中的一種對映體發(fā)生反應(yīng)而生成不同化合物，從而達(dá)到對映異構(gòu)體分離和檢測的目的。

D-氨基酸氧化酶（D-amino acid oxidase，DAAO）是一種以黃素腺嘌呤二核苷酸（Flavin adenine dinucletide，F(xiàn)AD）為輔基的典型黃素酶。DAAO催化D-氨基酸生成相應(yīng)的α-酮酸和氨。在分子氧存在的條件下，還原性FAD被氧化，并將氧轉(zhuǎn)化為過氧化氫；亞氨基酸水解成為α-酮酸和氨，當(dāng)體內(nèi)存在過氧化氫時，α-酮酸即發(fā)生脫羧產(chǎn)生相應(yīng)的酸。在過氧化物與過氧化物酶存在的條件下，N-乙基-N-（2-羥基-3-磺丙基）間甲苯胺鈉鹽（TOOS）與4-氨基安替比林（4-Aminoantipyrine，4-AAP）氧化偶合，形成穩(wěn)定的紫色或藍(lán)色物質(zhì)，該物質(zhì)在550 nm下有吸收峰，根據(jù)550 nm下吸光度的變化可以定量測定D-氨基酸的含量。

但D-氨基酸氧化酶并不能作用于所有的D-氨基酸，來自豬腎的D-氨基酸氧化酶對D-天門冬酰胺，D-半胱氨酸，D-谷氨酸等沒有催化活性，而來自三角酵母的D-氨基酸氧化酶則對D-酪氨酸，D-谷氨酸，D-賴氨酸等沒有催化活性［12］。因此，對于這些類型的D-氨基酸則需要更專一的酶來檢測。Fisher等［13］發(fā)現(xiàn)阿爾茨海默病人腦灰質(zhì)中D-Asp明顯高于正常人，利用D-天門冬氨酸氧化酶（DAspO）催化 D-天門冬氨酸和 D-谷氨酸氧化生成草酰乙酸和α-酮谷氨酸，然后在蘋果酸脫氫酶和谷氨酸脫氫酶的作用下與 NADH 反應(yīng)生成 L-蘋果酸和 L-谷氨酸，通過 NADH 的變化，可測定出人血液中D-氨基酸的含量［14］。

酶學(xué)檢測方法具有很強(qiáng)的選擇性，即只對D-同分異構(gòu)體有活性。這種方法價格便宜，效率高，適宜于從混合樣品中特異的專一的檢測出D-氨基酸。

1.2 氣相層析法

氣相層析法先將氨基酸衍生為易氣化的物質(zhì)，利用氣態(tài)試樣中各組分在兩相間的分配系數(shù)不同進(jìn)行分析。目前有硅烷化、酯化和酰化等衍生法［15］。由于樣品需要脫鹽處理，衍生處理時還要求無水及高溫條件，而且用一根色譜柱無法測定全部氨基酸，故此法在氨基酸分析檢測中應(yīng)用并不廣泛。

1.3 高效液相法

高效液相法是根據(jù)各組分在兩相間分配系數(shù)不同，經(jīng)過反復(fù)的吸附—解吸過程對其進(jìn)行分離檢測。液相色譜法根據(jù)作用機(jī)理的不同又分為如下幾種：手性衍生化試劑、手性固定相分離、手性流動相和柱切換系統(tǒng)。

1.3.1 手性衍生化試劑 用于氨基酸對映體分離的手性衍生化試劑有很多種，其中鄰苯二甲醛（o-Phthalaldehyde，OPA）-手性巰基化合物是最常用的衍生化試劑，所有伯胺類的氨基酸對映體都能與之反應(yīng)從而實現(xiàn)分離。OPA與巰基試劑，通常是β-巰基乙醇（β-Mercap-toethanol，β-MCE）連用，在堿性條件下與一級胺反應(yīng)產(chǎn)生熒光產(chǎn)物1-巰代-2-烷基-異吲 哚（λEX=340 nm，λEM-450 nm）［16］。OPA還可與Boc-L-Cys聯(lián)用進(jìn)行D-氨基酸的檢測和分離，圖1即為部分氨基酸以Boc-L-Cys-OPA為衍生化試劑衍生處理后的高效液相色譜檢測圖。由圖1可知，通過這種方法處理后，D型和L型氨基酸可以得到很好的分離［17］。

1.3.2 手性固定相分離法（CSP） 由于大部分氨基酸沒有紫外吸收，所以采用直接法分離氨基酸對映體時仍需要非手性試劑進(jìn)行柱前或柱后衍生化（其中柱前衍生較為普遍），以提高檢測靈敏度。常使用的非手性衍生化試劑多為強(qiáng)熒光試劑，如NBD-F、DBD-F和ABD-F等。對于生物樣品中的氨基酸對映體分析，最常用的手性固定相為Pirkle型手性固定相，環(huán)糊精類手性固定相在氨基酸對映體分析中也有廣泛應(yīng)用。Hamase等［18］用 Pirkle 型手性柱分離了17對構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸對映體衍生物（NBDAA），并結(jié)合反相高效液相色譜法和Pirkle型手性固定相手性分離，分別測定了雄性和雌性大鼠腦組織內(nèi)D-天門冬氨酸、D-絲氨酸、D-丙氨酸和D-亮氨酸的分布，以及它們隨年齡的變化情況。

1.3.3 手性流動相色譜法 手性流動相色譜法（CMP）也稱手性流動相添加法，在氨基酸對映體分析中，使用最早、最多的是配基交換型手性添加流動相（CLEC），主要分離方式是以光學(xué)活性的氨基酸（常用L-脯氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸等）或其衍生物為手性配基，與二價金屬離子（常用銅離子）形成螯合物，添加于流動相中，被分離的氨基酸對映體衍生物（非手性試劑衍生）與手性配基及二價金屬離子形成非對映三元絡(luò)合物，最后在反相色譜條件下實現(xiàn)分離。手性冠醚是常用的手性固定相，Armstrong等［19］用手性冠醚固定相結(jié)合ODS柱成功分離了苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的對映異構(gòu)體。

1.3.4 柱切換系統(tǒng) 手性固定相色譜和手性流動相色譜法對對映異構(gòu)體的分離有很好的選擇性，但對相似結(jié)構(gòu)的物質(zhì)（如L-氨基酸之間）分離效果較差。對于復(fù)雜的生物樣品，可利用柱切換系統(tǒng)，采用多維色譜（或稱串聯(lián)色譜）法，高效、靈敏地分析生物樣品中的D-氨基酸。

1.4 生物傳感器檢測法

一般來說，采用高效液相法、氣相色譜法或毛細(xì)管電泳法是檢測食品、飲料及生物樣品中D-氨基酸含量的有效分析方法，這些方法安全可靠、靈敏度很高，但是其專業(yè)化程度高、操作耗時和成本昂貴等方面原因制約著它們在食品工業(yè)方面的應(yīng)用。對于常規(guī)分析和質(zhì)量控制措施來說，開發(fā)簡單、快捷的分析方法迫在眉睫，生物傳感器則恰好滿足這些要求。

在過去的幾年里，許多研究小組提出使用酶反應(yīng)器檢測D-氨基酸。通過測定固定化酶豬腎D-AAO催化反應(yīng)所產(chǎn)生的過氧化氫的量計算出D-氨基酸的量。但這些傳感器的使用在一定程度上因哺乳類來源的相關(guān)酶的底物特異性及對酸性氨基酸幾乎沒催化活力而受到限制。

Rosini等［20］開發(fā)了一種生物傳感器，它解決了以上兩個問題。第一個問題可以通過使用來自酵母的D-氨基酸氧化酶來解決，這個酶具有更高的轉(zhuǎn)換率，更廣泛的底物特異性，以及與FAD輔因子的緊密結(jié)合［21］。第二個問題最近也得到解決，Sacchi等［22，23］通過理性設(shè)計和定向進(jìn)化技術(shù)相結(jié)合成功篩選獲得了具有廣泛的底物特異性的RgDAAO突變體，同時這些突變體對酸性、中性以及非天然的氨基酸的催化效率也有顯著提高。

這個傳感器以一個三極管電極和RgDAAO突變體為基礎(chǔ)（圖2）［20］。這個突變體酶蛋白最好能夠作用于所有的D-氨基酸。Rosini等［20］成功構(gòu)建了RgDAAO的多個突變體，其中M213G和T60A/Q144R/K152E突變體表現(xiàn)最佳。當(dāng)混合物中的D-丙氨酸含量大于等于20%，且酶處于固定化形式時，這些酶對催化D-氨基酸的反應(yīng)表現(xiàn)出很低的變化，即它們催化D-氨基酸的活力相差不多。這個基于RgDAAO的裝置成功地用于檢測奶酪樣品中D-氨基酸的總量，所檢測的奶酪中D-氨基酸的含量與文獻(xiàn)報道相一致［11］。由此可見，這是一種有效地檢測D-氨基酸的方法。

圖2 生物傳感器檢測D-氨基酸示意圖［20］

2 小結(jié)

酶法、高效液相法和生物傳感器法是幾種常用的D-氨基酸的檢測方法。酶法價格便宜，效率高，適宜于從混合樣品中檢測D-氨基酸；而高效液相法檢測結(jié)果精確，目前被廣泛用于D-氨基酸的分離和檢測，但該方法專業(yè)化程度和成本均較高。生物傳感器法操作簡單、準(zhǔn)確度高，不過酶蛋白選擇有一定的局限性，且需要固定化處理。所以，對于D-氨基酸的檢測還需要在現(xiàn)有試驗手段的基礎(chǔ)上進(jìn)一步加深研究，希望得到一種更加簡便易行且靈敏度高的檢測方法。

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