轉ZjAPX基因擬南芥對NaCl、干旱脅迫的耐性研究

郭慧娜 孟玉平 郝子琪 李倩 曹秋芬，3

（1.山西大學生物工程學院，太原 030031；2.山西省農業科學院生物技術研究中心，太原 030031；3.農業部黃土高原作物基因資源與種質創制重點實驗室，太原 030031）

抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）是植物體內酶促抗氧化系統中ASA-GSH氧化還原途徑的重要組分，是清除H2O2的關鍵酶，對H2O2有較高的親和力，在還原底物抗壞血酸的存在下將H2O2還原為H2O。大量的研究表明，APX 的表達受各種環境脅迫因子，如干旱、高鹽、除草劑、低溫、病原菌侵染的誘導。馬長樂等［1］研究表明，當堿蓬受到NaCl脅迫時，其SsAPX的表達量增高。在煙草葉綠體中，過量表達擬南芥APX基因能夠清除活性氧，提高轉基因株系耐鹽能力［2］。木本植物中白樺抗壞血酸過氧化物酶（APX）基因已經被克隆，研究表明NaCl脅迫誘導了白樺葉片中APX的表達［3］；木本果樹中葡萄的APX［4］和蘋果的APX基因也已被克隆［5］，李穎等［6］利用農桿菌介導已經將蘋果的APX基因轉入“嘎啦”組培苗。

棗樹抗旱、耐鹽堿、耐瘠薄，這些特性與其體內的抗氧化系統有密切關系，我們從棗樹結果枝cDNA文庫中篩選出一個抗壞血酸過氧化物酶基因，命名為ZjAPX，在DDBJ/EMBL/GenBank的注冊號為AB608053，并對ZjAPX進行了原核表達蛋白的研究［7］和cDNA序列生物信息學分析及完整開放閱讀框植物表達載體PEZR（K）-LNY-ZjAPX的構建［8］。本研究通過凍融法將已構建的植物表達載體轉入農桿菌菌株LBA4404，并借助農桿菌遺傳轉化獲得轉ZjAPX擬南芥，通過對轉基因擬南芥進行NaCl、干旱脅迫，觀察植株的表型變化、檢測其體內ZjAPX的表達，探討ZjAPX在改善植物抗旱耐鹽性方面的生物學作用，旨在為利用生物工程手段提高植物抗旱、耐鹽性提供基因資源。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用重組植物表達載體PEZR（K）-LNY由山西省農業科學院生物技術研究中心植物細胞及胚胎學研究室保存，前期研究中已經將ZjAPX成功連接到PEZR（K）-LNY載體上，構建了PEZR（K）-LNY-ZjAPX［8］，該載體攜帶篩選標記基因NPT-Ⅱ和黃色熒光蛋白報告基因YFP。野生型擬南芥株系（Arabidopsis thaliana Columbia）和根癌農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）LBA4404菌株由該研究室保存。

卡那霉素（Kanamycin，Kan）購自上海生工生物工程服務有限公司；NaCl、YEB、1/2MS培養基中所用試劑均購自天津天大化工；擬南芥的培養基質購自山西省農業科學院園藝作物研究所；飽和酚、DEPC、RNA和DNA提取過程中所用到的試劑均購自上海生工生物工程有限公司。DL2000 Marker購自北京全式金生物技術有限公司；反轉錄試劑盒（PrimeScript?RT Master Mix），熒光定量PCR試劑盒（PrimeScriptTMRT reagent Kit），DNaseⅠ，熒光定量過程中所用的PCR管均購自大連TaKaRa（寶生物）工程有限公司。用于PCR鑒定和熒光定量的引物由上海生工生物技術服務有限公司合成；熒光定量PCR儀為Applied Biosystems 的7300 Real Time PCR System。

1.2 方法

1.2.1 擬南芥的培養 將擬南芥種子消毒后，播于1/2MS固體培養基上，封口。春化2 d后，將其置于21℃，16 h/8 h光周期條件下進行培養。當擬南芥長出兩片真葉時，移栽到營養基質中繼續培養。

1.2.2 農桿菌工程菌PEZR（K）-LNY-ZjAPX-L的構建及轉化擬南芥 通過凍融法將構建成功的重組質粒PEZR（K）-LNY-ZjAPX轉入農桿菌LBA4404，挑取陽性菌落進行PCR鑒定轉化子，將陽性菌株送華大基因公司測序。

1.2.3 轉基因植株的篩選 將T0代種子消毒后，播于含有卡那霉素的1/2MS抗性平板上篩選，篩選出的抗性植株分株系收獲種子，記為T1代。同樣，將T1代種子抗性篩選，收獲T2種子。將T2代種子消毒后播于含有卡那霉素的1/2MS固體培養基上，在平板上生長全為綠苗的為純合的轉基因植株。

1.2.4 轉基因植株的分子鑒定 采用CTAB法提取T2代轉基因擬南芥的基因組DNA，通過蛋白核酸檢測儀檢測其濃度和純度；以提取的基因組DNA為模板進行PCR檢測，PCR反應體系總體積為20 μL，其 中：10×PCR Buffer 2 μL，dNTPs 0.2 μL，Taq聚合酶0.1 μL，上下游引物各1 μL（20 pmol/μL），用滅菌無離子水補足20 μL。

APX1正向引物：5'-TGAATTCAGATGGGGAAGTGCTAC-3'；APX2反向引物：5'-ATCCCGGGTAGCATCAGCAAATC-3'。

PCR反應條件為：95℃預變性5 min；94℃變性1 min，54℃退火1 min，72℃延伸2 min，共30個循環；最后72℃延伸5 min。

1.2.5 轉基因植株T2代種子的NaCl脅迫處理 種子脅迫培養基為：1/2MS培養基中分別加不同濃度的NaCl，即100、200、300和500 mmol/L，以不加NaCl的1/2MS培養基為對照。

將PCR鑒定為轉基因株系的擬南芥T2代的種子消毒后，每一個株系在每一個濃度的培養基上均播種約20顆種子，同時每個培養皿中播野生型擬南芥種子作對照，觀察種子萌發及植株生長狀況。

1.2.6 轉基因T2代植株的NaCl和干旱處理 將正常生長3周左右的轉基因擬南芥植株分別進行干旱（不澆水）和澆400 mmol/L NaCl處理，以正常澆水為對照，10 d后調查植株生長情況，并分別取樣冷凍于液氮后保存在-80℃超低溫冰箱中，備用。

1.2.7 NaCl和干旱脅迫下轉基因擬南芥中ZjAPX基因的表達 用CTAB法［9］提取上述處理樣品的RNA，用DNaseⅠ除去DNA。用蛋白核酸分光光度計檢測其A260/280在1.8-2.0之間，凝膠電泳發現28S和18S的rRNA條帶完整，28S條帶的亮度為18S亮度的2倍，表明總RNA有較好的完整性和純度，能滿足反轉錄的要求。反轉錄成cDNA。反轉錄體系：5×Prime Script Buffer 4 μL、Total RNA 1 μg、總體積15 μL。反應條件：37℃ 15 min，85℃ 5 s。用Realtime PCR的方法分析基因的轉錄表達情況。本研究采用Real-time PCR相對定量法，分析轉基因植株不同脅迫條件下ZjAPX mRNA的相對表達量。ZjAPX的上游引物為：5'-TCGATATCGCTGTCAGACTAC-3'；下游引物：5'-TTGTCCTCTCTTCCTGGATG-3'；可擴增出145 bp的片段。以擬南芥Actin（At3g18780）基因作內參，其上游引物：5'-ACCTCATGAAGATCCTTACAG-3'；下游引物：5'-GATGGAAGAGCTGGTCTTTG-3'；可擴增出146 bp的片段定量PCR反應體系總體積為20 μL，含上、下游引物各0.4 μL（20 pmol/μL），cDNA 1 μL（100 ng），SYBR Premix EX TaqTMⅡ10 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL，ddH2O 7.8 μL。反應條件為：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，60℃延伸31 s，40個循環?；蛳鄬Χ勘磉_分析采用2-ΔΔCt法，ΔΔCt = 轉基因［Ct（ZjAPX）-Ct（Actin）］-野 生 型［Ct（ZjAPX）-Ct（Actin）］，每個樣品重復3次。

對于天文攝影師來說，自然少不了大大小小的器材，這些都能整齊地收納到一個體積小巧的背包中。Alyn目前使用的是索尼A7 III微單相機，作為靜態照片拍攝的主力，但鏡頭的選擇更為重要。他需要廣角鏡頭，也需要光圈盡可能大，這樣就可以在不使用過高ISO的前提下，讓更多的光線進入相機。

2 結果

2.1 農桿菌工程菌株的構建

將構建好的植物表達載體PEZR（K）-LNY-ZjAPX轉入農桿菌LBA4404，涂布于含有卡那霉素的YEB固體培養基上，28℃過夜培養，挑選生長良好的單菌落，進行PCR檢測，產生一條大小約為750 bp的特異條帶（圖1），兩個菌株測序表明，重組載體上的序列與原克隆序列完全相同，證明含PEZR（K）-LNY-ZjAPX的農桿菌工程菌構建成功。

2.2 轉基因植株的篩選

將T0代種子播在含有卡那霉素的1/2MS培養基上篩選，未轉化的擬南芥種子長出兩片子葉后黃化死亡，只有轉基因擬南芥種子能夠繼續正常生長，如圖2所示。經過抗性篩選共獲得24個轉基因株系，24個株系整體生長狀況良好，沒有發現異常形態及性狀。

2.3 轉基因植株的PCR檢測

將篩選獲得的24個T0轉基因株系繼續分別用含有卡那霉素的1/2MS培養基篩選至獲得T2代種子，播種其中的5個株系3、8、9、11、20進行PCR鑒定證明，5個株系均擴增出了750 bp的條帶（圖3），表明5個株系均為轉ZjAPX基因植株。

2.4 轉基因株系種子對NaCl的耐性

播種后第7天，300 mmol/L和500 mmol/L NaCl培養基上種子沒有發芽長出子葉，而0 mmol/L NaCl和100 mmol/L NaCl的培養基上子葉展開，10 d長出兩片真葉，但含100 mmol/L NaCl培養基上的幼苗葉子卷曲；15 d轉基因擬南芥的幼苗的長勢明顯好于野生擬南芥；30 d野生型植株幼苗根系短小、葉片發黃接近死亡，而轉基因株系幼苗的根系和葉片明顯優于野生型植株，如圖4所示。

2.5 轉基因株系的耐NaCl、耐旱性

對轉基因植株進行NaCl和干旱脅迫處理15 d后觀察，與正常澆水的對照相比NaCl處理的植株均表現葉片變黃，但轉基因株系比野生型植株更健壯、葉片大、葉色稍綠。干旱處理的轉基因株系均正常生長，株系3和株系11葉片表現為深綠色，株系8葉色正常并已經抽苔，株系9長勢稍差，而此時野生型植株已干枯死亡。

2.6 NaCl和干旱脅迫下轉基因植株中ZjAPX基因的表達

熒光定量PCR分析結果表明，NaCl和干旱脅迫10 d的轉基因株系的ZjAPX表達量均顯著高于野生型株系，如圖5所示。其中以株系3表達量最高，相對表達量分別為114%和146%，其次株系8分別為73%和76%，株系11分別為17%和20%，株系9均為11%；NaCl脅迫條件下野生型植株ZjAPX表達量很低為0.1%幾乎為0，而干旱脅迫10 d采樣時野生型植株已經死亡。這一結果與上述2.5中的外部形態觀察結果基本一致，株系3在脅迫條件下生長最好，ZjAPX的相對表達量也最高；株系9在脅迫條件下生長最弱，ZjAPX的相對表達量也最低；證明轉ZjAPX植株的耐NaCl和耐干旱性與ZjAPX的高表達呈正相關，ZjAPX的高表達提高了植株耐NaCl和耐干旱的能力。

3 討論

植物在受到鹽、干旱等逆境脅迫時會產生大量的活性氧（ROS），ROS的種類包括過氧化氫（H2O2）、羥自由基（OH-）、超氧陰離子（O2-）。當ROS代謝平衡遭到破壞、產生的量超出植物體本身的清除能力時，過剩的H2O2會生成破壞力更強的HO-，從而導致膜脂的過氧化，破壞生物膜的結構與功能，蛋白質和DNA等生物大分子受到傷害，細胞物質交換平衡遭到破壞，生理生化代謝出現紊亂，使植物生長受到抑制［10］。因此，能否及時清除過量積累的活性氧，緩解脅迫對植物細胞造成的傷害，在一定程度上反映了植物耐鹽、耐旱等抗逆性的強弱。研究表明，在高等植物中，抗壞血酸（Ascorbic acid，ASA）-谷胱甘肽（Glutathione，GSH）循環是植物葉綠體和胞質中清除H2O2的主要系統，而APX是這個系統的關鍵酶［11］，因此APX的表達量高低直接影響植物在逆境中的生存能力。

對APX的研究發現，在干旱、臭氧、乙烯、除草劑、冷熱等逆境條件，以及病原體侵染以及果實成熟過程中，均能引起APX的mRNA 水平及其活性的增加［12］。本研究證明在NaCl脅迫條件下，轉ZjAPX擬南芥的種子萌發和萌發后幼苗的生長、根系明顯優于野生型植株，說明轉ZjAPX改善了擬南芥種子及幼苗對NaCl的耐性。在NaCl和干旱脅迫條件下，轉ZjAPX擬南芥植株的生長勢均明顯優于野生型植株，熒光定量PCR分析也證明ZjAPX基因在mRNA水平的表達量明顯高于野生型植株；同時研究還表明轉基因株系之間抗脅迫能力存在差異，株系3、8、11生長勢優于株系9，ZjAPX基因表達量也表現出明顯的不同，依次為株系3、8、11、9。這一結果說明ZjAPX基因在植物體內高表達量清除了活性氧，提高了植株對NaCl和干旱脅迫的抗性；由于不同株系中導入的基因拷貝數、基因整合的位置存在差異，因而株系之間對NaCl和干旱的耐性也表現不同。

Gueta-Dahan等［13］對耐鹽和鹽敏感的柑橘中抗氧化酶的活性發現，超氧化物歧化酶、谷胱甘肽還原酶等的活性在兩者之間差別不大，而耐鹽柑橘中的APX活性大大高于鹽敏感柑橘；Tsugane等［14］也發現與野生型擬南芥相比，在鹽脅迫條件下能進行光合自養的擬南芥隱性突變體中APX的活性顯著增強，而其他幾種抗氧化物酶的活性差別不大，因此認為APX是決定耐鹽與否的關鍵酶。本研究結果也證明了這一點。

增強植物抗逆性的重要途徑之一是提高植物體內活性氧清除酶類的活性及抗氧化代謝水平。利用基因工程手段將一些具有抗逆功能的轉錄因子導入植株中，是目前普遍使用的提高植物抗逆性的策略。

4 結論

本研究利用農桿菌介導法將ZjAPX基因轉入到模式植物擬南芥，轉ZjAPX擬南芥T2株系的種子萌發和植株生長均較野生型株系耐鹽、耐旱，熒光定量PCR檢測轉基因植株在干旱和鹽脅迫處理10 d后目的基因ZjAPX的表達量顯著高于野生擬南芥，證明轉ZjAPX能夠提高植物的耐鹽和耐旱性。

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