響應面法優化超聲波輔助提取香菇中半胱氨酸亞砜裂解酶的工藝

劉 瑩，袁 巖，雷霄宇，黃 文，王 益*

(華中農業大學食品科學技術學院，湖北 武漢 430070)

香菇由于其營養價值和藥用價值高，深受消費者喜愛，然而進入新世紀以來，香菇中甲醛超標導致的食品安全問題困擾著香菇產業的發展。日本學者Yasumoto[1-4]、Iwami[5]和Fujimoto[6]等在研究香菇特征風味形成機理的過程中發現香菇可以產生內源型甲醛，并且是香菇特征風味物質酶學代謝途徑的副產物，半胱氨酸亞砜裂解酶(C-S lyase)是該酶學代謝途徑中的一種關鍵酶。

目前，對香菇中半胱氨酸亞砜裂解酶的研究不夠深入，不能為香菇內源型甲醛的調控提供理論依據。對香菇內源型甲醛進行調控，必須明確香菇中半胱氨酸亞砜裂解酶的基本酶學性質和結構，獲得足量的半胱氨酸亞砜裂解酶是對其基本酶學性質和結構進行研究的前提。由于香菇中半胱氨酸亞砜裂解酶的含量較低，一般為1%左右[6]，且半胱氨酸亞砜裂解酶存在于香菇細胞內，常規靜止浸提方法的提取率較低而且耗時，容易造成酶活損失。據文獻報道利用超聲波技術提取生物酶具有提取時間短、原料利用率高、酶不易失活等優點[7-11]。本實驗采用超聲波輔助法提取香菇中半胱氨酸亞砜裂解酶，在單因素試驗基礎上，采用響應面分析的方法對半胱氨酸亞砜裂解酶的提取工藝進行優化。半胱氨酸亞砜裂解酶提取工藝的確定，為深入研究該酶的酶學性質提供條件，從而為香菇內源型甲醛的調控提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮香菇由華中農業大學應用真菌研究所提供；S-甲基-L-半胱氨酸亞砜、2,4-二硝基苯肼 美國Sigma公司；Tris-base 韓國Biosharp公司；其余試劑均為國產AR級。

1.2 儀器與設備

UV-1700型紫外-可見分光光度計 日本島津公司；Avanti J-E型冷凍離心機 美國Beckman公司；US3120DH型超聲波清洗器 北京優晟聯合科技有限公司；Waring組織粉碎機 德國Karl Kolb公司。

1.3 方法

1.3.1 香菇中半胱氨酸亞砜裂解酶的提取方法

精確稱取10.0g新鮮香菇于組織搗碎機中，加入一定量的0.1mol/L的Tris-HCl (pH 7.6) 緩沖液進行勻漿處理5min。將勻漿液置于250mL三角瓶中，用超聲波輔助法提取半胱氨酸亞砜裂解酶，提取液經10000×g離心處理之后，取上清液測定酶活，計算提取率。

1.3.2 半胱氨酸亞砜裂解酶的酶活測定方法及提取率的計算

半胱氨酸亞砜裂解酶催化S-甲基-L-半胱氨酸亞砜生產丙酮酸，酶活性由丙酮酸的生產量反映[12]。反應體系為0.1mol/L的Tris-HCl(pH8.4)緩沖液2mL、酶液0.2mL、4.0μmol/mL底物0.2mL，在具塞試管中于37℃反應5min后立即加入0.4mL 10%三氯乙酸終止反應，加入1mL 2,4-二硝基苯肼，37℃保溫5min，然后加入5mL 2.5mol/L NaOH溶液，反應10min后于520nm波長處比色。以緩沖液、鈍化酶、底物、三氯乙酸、2,4-二硝基苯肼、NaOH反應體系為空白。酶活力單位定義：在上述反應條件下，每分鐘產生1μmol丙酮酸定義為一個酶活力單位(U)。

半胱氨酸亞砜裂解酶提取率/(U/g)＝樣品半胱氨酸亞砜裂解酶活性/香菇質量

1.3.3 單因素及響應面試驗設計

設定液料比20：1、提取時間20min、提取功率96W，固定其他條件，分別考察提取時間(10、20、30、40、50min)、提取功率(24、48、72、96、120W)和液料比(5：1、10：1、15：1、20：1、25：1)對香菇中半胱氨酸亞砜裂解酶提取率的影響。采用超聲波輔助法提取半胱氨酸亞砜裂解酶時溫度控制在4℃，提取結束后于4℃條件下離心處理。依據單因素試驗結果，結合Box-Behnken試驗設計原理，采用響應面法分析提取時間、提取功率和液料比對響應值的影響。

2 結果與分析

2.1 超聲波輔助法提取半胱氨酸亞砜裂解酶的單因素試驗

2.1.1 提取時間對半胱氨酸亞砜裂解酶提取率的影響

由圖1可知，半胱氨酸亞砜裂解酶的提取率隨提取時間的延長不斷提高，在提取時間為20min時達到最大。20min之后，隨著提取時間的繼續延長，半胱氨酸亞砜裂解酶的提取率出現明顯的下降趨勢。說明延長超聲波處理時間可以促進破碎細胞內的半胱氨酸亞砜裂解酶擴散到提取緩沖液中，當超聲波處理時間為20min時，細胞內的半胱氨酸亞砜裂解酶已經基本溶出，此時半胱氨酸亞砜裂解酶的提取率到達最大值。過長的超聲波處理時間可能會導致半胱氨酸亞砜裂解酶的酶結構破壞，半胱氨酸亞砜裂解酶的酶活性降低，造成其提取率下降[7]。

圖 1 提取時間對半胱氨酸亞砜裂解酶提取率的影響Fig.1 Effect of extraction time on C-S lyase extraction

2.1.2 提取功率對半胱氨酸亞砜裂解酶提取率的影響

圖 2 提取功率對半胱氨酸亞砜裂解酶提取率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on C-S lyase extraction

由圖2可知，超聲功率由24W增加到96W的過程中，半胱氨酸亞砜裂解酶的提取率顯著增大，超聲功率達到96W時，半胱氨酸亞砜裂解酶的提取率具有最大值；但隨著超聲功率繼續增大，半胱氨酸亞砜裂解酶的提取率降低。這說明在超聲功率小于96W時，超聲功率的增強，介質質點運動加速，使半胱氨酸亞砜裂解酶迅速從細胞內游離出并溶解于提取緩沖液中，隨著空化作用、均勻化作用的加強，半胱氨酸亞砜裂解酶的提取率達到最大值[13]。超聲功率過大會引起體系局部的高溫、高壓，造成酶結構的破壞[14]，降低半胱氨酸亞砜裂解酶的酶活，降低其提取率。

2.1.3 液料比對半胱氨酸亞砜裂解酶提取率的影響

由圖3可知，隨著液料比的增大，半胱氨酸亞砜裂解酶的提取率逐漸上升，液料比增加到15：1時，半胱氨酸亞砜裂解酶的提取率到達最大值；液料比繼續增大，半胱氨酸亞砜裂解酶的提取率基本保持不變。這說明一定范圍內液料比的增大有利于半胱氨酸亞砜裂解酶從破碎細胞內游離擴散出來，當液料比達到一定值時，細胞內半胱氨酸亞砜裂解酶的溶出量已經達到最大限，此時繼續增大液料比，對半胱氨酸亞砜裂解酶的提取率影響不大。過大的液料比會造成后續分離純化半胱氨酸亞砜裂解酶時能源和試劑的浪費，不利于實際操作[15]。

圖 3 液料比對半胱氨酸亞砜裂解酶提取率的影響Fig.3 Effect of material-to-liquid ratio on C-S lyase extraction

2.2 超聲波輔助法提取半胱氨酸亞砜裂解酶的響應面試驗

2.2.1 響應面試驗設計

為優化單因素試驗得到的工藝條件，以提取時間、提取功率和液料比為因素，采用Box-Benhnk設計試驗，因素水平編碼、試驗方案及結果見表1。

表 1 響應面試驗設計及結果Table 1 Experimental trails and results for response surface analysis

2.2.2 因素與提取率模型的建立及顯著性檢驗

應用Design Expert 8.0軟件對表2中的數據進行分析，獲得自變量與半胱氨酸亞砜裂解酶提取率(Y)的回歸方程：Y＝49.0881＋0.6848A＋2.3249B－0.2868C＋0.2169AB＋0.2763AC＋0.7442BC－0.2094A2－7.5598B2－2.0315C2。

由表2可以看出，該回歸模型P＜0.0001，回歸模型達到極顯著，失擬項P＝0.1640＞0.05，不顯著；回歸模型因變量和自變量之間的關系顯著(R2＝0.9944)，說明模型的擬合程度較好，試驗誤差小。可以利用該方程獲得最佳提取工藝條件。分別對該方程各自變量(A、B、C)求極值，得到極值點為A＝0.1627，B＝0.1548，C＝0.0282，即提取時間21.63min、提取功率99.72W、液料比15.14：1(mL/g)。在此最優條件下，半胱氨酸亞砜裂解酶的提取率為49.37U/g。參考實際操作以及超聲波儀器功率選擇，將優化后的工藝參數調整為提取時間21.5min、提取功率100W、液料比15：1(mL/g)，在此條件下進行3次驗證實驗，半胱氨酸亞砜裂解酶的平均提取率為48.76U/g，與理論值基本相符，說明回歸模型能較好地預測超聲波輔助法提取半胱氨酸亞砜裂解酶的提取率，優化得到的提取條件參數是準確可靠的，具有實際應用價值。采用常規靜止浸提法，提取時間為60min，在此條件下進行3次驗證實驗，半胱氨酸亞砜裂解酶的平均提取率為26.21U/g。結果表明通過響應面優化得到的工藝參數具有實際應用價值，半胱氨酸亞砜裂解酶的提取率提高了86.04%。

表 2 回歸方程的方差分析Table 2 Analysis of variance for the developed regression equation

由表2可知，超聲波輔助法提取香菇中半胱氨酸亞砜裂解酶的工藝參數中，影響提取率的各因素的主效應關系為提取功率＞提取時間＞液料比，其中提取功率(B)和提取時間(A)達到極顯著水平，液料比(C)沒有顯著性。

2.2.3 交互作用分析

響應面圖能比較直觀的反映各因素之間的交互作用，通過多元回歸方程做響應面圖，超聲波輔助法提取香菇中半胱氨酸亞砜裂解酶工藝中提取時間、提取功率和液料比之間的交互作用對提取率的影響如圖4所示。

由圖4a可知，提取功率的等高線比提取時間的等高線排列密集，表明提取功率的主效應大于提取時間，提取時間的拋物線坡度趨于平緩，對響應值的影響不大，交互作用不顯著。考慮到提取時間過長會造成半胱氨酸亞砜裂解酶酶活下降，可以將提取時間控制在20min左右。

由圖4b可知，提取時間和液料比的響應曲面坡度相對平緩，等高線排列疏松且趨向于圓形，表明提取時間和液料比的交互作用不顯著，這與統計結果相一致(PAC＝0.3275＞0.05)。由于液料比對半胱氨酸亞砜裂解酶提取率影響不大，過大的液料比不利于下一步對半胱氨酸亞砜裂解酶進行分離純化，因此，可以選擇較低的液料比進行提取。

圖 4 兩因素交互作用對半胱氨酸亞砜裂解酶提取率的影響Fig.4 Response surface of the effect of two factors on C-S lyase extraction

由圖4c可知，提取功率和液料比的響應面坡度陡峭，等高線排列緊密且趨向于橢圓，表明提取功率與液料比的交互作用顯著[16]。液料比在較低水平時，提取功率的響應拋物線的最高點也在較低水平，此時，提取功率對半胱氨酸亞砜裂解酶的提取率的影響不明顯；隨著液料比的增大，提取功率的響應拋物線的最高點在較高水平，此時提取功率對半胱氨酸亞砜裂解酶的提取率的影響比較明顯。

3 結 論

本實驗采用超聲波輔助法提取香菇中半胱氨酸亞砜裂解酶，該方法有利于半胱氨酸亞砜裂解酶從細胞中充分溶出，從而顯著提高了香菇中半胱氨酸亞砜裂解酶的提取率，縮短了提取時間。該方法可以快速、高效地提取出香菇中半胱氨酸亞砜裂解酶，為進一步分離純化該酶并研究其酶學性質和酶分子結構提供了條件，為通過酶分子進化工程手段調控香菇內源型甲醛提供理論依據。

為進一步優化超聲波輔助法提取香菇中半胱氨酸亞砜裂解酶的工藝，本實驗考察了提取時間、提取功率和液料比3個因素對半胱氨酸亞砜裂解酶提取率的影響，通過單因素試驗和響應面試驗設計得出各因素對提取率的影響從大小依次為提取功率＞提取時間＞液料比。最終確定提取工藝條件為提取時間21.5min、提取功率100W、液料比15：1(mL/g)，在此最佳工藝條件下，香菇中半胱氨酸亞砜裂解酶的提取率為48.76U/g，比常規靜止浸提法提高了86.04%。

[1] YASUMOTO K, IMAIDA K, MITSUDA H. A new sulfur-containing peptide from Lentinus edode acting as a precursor for lenthionine[J]. Agric Biol Chem, 1971, 35(13)： 2059-2069.

[2] YASUMOTO K, IMAIDA K, MITSUDA H. Enzyme-catalized evolution of lenthionine from lentinic acid[J]. Agric Biol Chem, 1971, 35(13)： 2070-2080.

[3] YASUMOTO K, IMAIDA K, MITSUDA H. Enzymatic cleavage of cysteine sulfoxide in Lentinus edodes[J]. Agric Biol Chem, 1975, 39(10)： 1947-1955.

[4] YASUMOTO K, IMAIDA K, MITSUDA H. Enzymatic formation of shii-take aroma from non-volatile Preeursor(s)-lenthionine from lentinicacid[J]. Mushroom Seienee, 1976, 9(1)： 371-383.

[5] FUJIMOTO K, TSURUMI T, WATARI M, et al. The mechanism of formaldehyde formation in shiitake mushroom[J]. Mushroom Science, 1976, 9(1)： 385-390.

[6] IWAMI K, YASUMOTO K. Alliinase-like enzymes in fruiting bodies of Lentinus edodes： their purification and substrate specificity[J]. Agric Biol Chem, 1980, 44(12)： 3003-3004.

[7] 勵建榮, 尹潔, 朱軍莉, 等. 響應面分析法優化香菇中γ-谷氨酰轉肽酶的超聲輔助提取條件[J]. 食品科學, 2010, 31(20)： 20-23.

[8] NABARLATZ D, VONDRYSOVA J, JENICEL P, et al. Hydrolytic enzymes in activated sludge： extraction of protease and lipase by stirring and ultrasonication[J]. Ultrasonics Sonochemistry, 2010, 17(5)： 923-931.

[9] 張富新, 陳錦屏, 李林強. 利用超聲處理提取皺胃酶的試驗研究[J]. 農業工程學報, 2004, 20(3)： 153-156.

[10] 吳燕燕, 王劍河, 李來好, 等. 羅非魚內臟蛋白酶超聲波提取工藝的研究[J]. 食品科學, 2007, 28(7)： 245-248.

[11] 王俊杰, 饒志明, 沈微. 超聲波萃取煙葉中3-磷酸甘油脫氫酶的研究[J]. 中國生物工程雜志, 2008, 28(8)： 74-77.

[12] YASUMOTO K, IWAMI K. S-substituted L-cysteine sulfoxide lyase from shiitake mushroom[J]. Methods in Enzymology, 1987, 143： 434-439.

[13] 于修燭, 王玲, 杜雙奎, 等. 響應面法優化枳椇子總黃酮超聲波提取工藝[J]. 食品科學, 2011, 32(12)： 125-129.

[14] 肖桂平. 木瓜蛋白酶超聲法提取工藝及其酶學性質[J]. 福建農林大學學報, 2005, 34(3)： 318-323.

[15] 賀寅, 王強, 鐘葵. 響應面優化酶法提取龍眼多糖工藝[J]. 食品科學, 2011, 32(2)： 79-83.

[16] 劉奉強, 肖鑒謀, 劉太澤. 應用響應面法優化超聲波提取荊芥中總黃酮的工藝[J]. 南昌大學學報, 2011, 33(2)： 149-155.