茶葉提取物對采后桃果苯丙氨酸解氨酶、多酚氧化酶、過氧化物酶活性的誘導

張紹珊，陳嬌嬌，楊曉萍,*

(1.園藝植物生物學教育部重點實驗室，華中農業大學園林學院，湖北 武漢 430070；2.浙江省松陽縣茶葉市場茶葉檢測中心，浙江 松陽 323400)

植物對機械損傷或病原菌浸染有著天然防御反應，遭受侵害時體內通常會發生一系列生理生化反應來增加自身的抵御能力，其中誘導相關抗性酶活性發揮了重要作用[1]。酚氧化酶(PPO)、過氧化物酶(POD)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)是植物體內重要的抗性酶，受傷或感病后植物PPO、POD和PAL等活性增強，與植物抗性的獲得呈現明顯的相關性[2-3]。因此，誘導植物PPO、POD和PAL等抗性酶活性被認為是發掘植物內在抗性機制以抵御病原菌浸染、機械損傷的重要對策。

目前，有關生防菌[4]、化學物質[5-6]、紫外線[7]等誘導植物感病過程中抗性酶活性增強的研究較多，有關植物提取物誘導植物感病過程抗性酶活性報道較少，僅Latha等[8]研究報道磨盤草等20種植物提取物通過誘導番茄葉POD、PPO、PAL活性的增強來防御番茄早疫病；Kagale等[9]研究報道夾竹桃等16種植物提取物通過增強小麥葉片POD、PAL活性來防御小麥紋枯病菌的侵染；楊書珍等[10]研究報道蜂膠提取物通過誘導柑橘果皮中PAL、POD、PPO等活性的增強來防御柑橘青霉病等，而有關植物提取物誘導采后果品機械損傷或感病過程中抗性酶活性防御病原菌浸染的相關研究還未見報道。

茶是國際健康飲品，茶葉及其所含功能成分有明顯抑菌能力[11-12]，可用于新鮮果品的防腐保鮮[13]，但其防腐保鮮機理研究還十分缺乏，更未見茶及其提取物誘導采后果品抗性酶活性的報道。本實驗以曙光油桃為試材，以桃灰霉病菌為供試菌，研究茶提取液對機械損傷或接種灰霉病菌桃果PPO、POD和PAL活性的誘導，為探明茶提取液防腐保鮮機理提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

病原菌：實驗所用病菌為灰霉病菌(B o t r y t i s cinerea)，分離于自然發病的桃果實，經分離、純化、形態分析及顯微觀察證實。將其接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)上，28℃恒溫培養3d，沿生長均勻、旺盛的菌落邊緣用直徑為5mm的打孔器打取菌餅，按10塊/100mL接種于馬鈴薯葡萄糖液體培養基(PD)中，在28℃、200r/min條件下振蕩培養4d，用勻漿機(12000r/min)勻漿30s，制成菌絲懸浮液備用。

果實：供試果實為曙光油桃(Prunus persica var. nectarina)，采自華中農業大學果樹標本園，選擇外觀整齊、成熟度八成熟、無病蟲害和機械損傷的果實，用2%次氯酸鈉浸泡3min后用自來水沖洗，自然晾干后備用。

茶葉提取物為本實驗室自制。以綠茶為原料，經60%乙醇提取、過濾，大孔吸附樹脂吸附、70%乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇，將濃縮樣品以水稀釋成茶葉提取液(茶多酚含量為1.1%)。

ScTRSum 53型紫外-可見分光光度計 上海棱光技術有限公司；TDL-5-A型高速離心機 北京醫用離心機廠。

1.2 方法

1.2.1 茶葉提取物對采后桃果實酶活性的誘導

用接種針在果實最大直徑處垂直刺4mm(深)×5mm(寬)的傷口，傷口晾干后分別接種無菌蒸餾水和6.0g/L茶葉提取液50μL，1.5h后分別再接種病菌懸浮液25μL。實驗處理如下：P1：果實打孔＋接種處理液；P2：果實打孔＋接種處理液＋接種B. cinerea；CK1：果實不打孔；CK2：果實打孔；CK3：果實打孔＋接種B. cinerea。果實晾干后貯藏于25℃，并保持90%左右的相對濕度。每處理50個果實，各處理重復3次，分別于0、24、48、72、96h取樣測定酶活性，每次測定的樣品取自10個果實的病健交界處(病斑與完好組織的交接部位)果肉。

1.2.2 PAL酶液制備與活性測定

5g果肉中加入0.5g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，再加入0.1mol/L的硼酸緩沖液20mL(pH8.8，含有10mmol/L巰基乙醇，50mmol/L EDTA-Na2)，冰浴勻漿，12000r/min、4℃離心20min，上清液用于酶活測定。PAL活性測定參照Assis等[14]的方法加以改進，在290nm波長處測定吸光度(A290nm)的變化，每小時每克鮮質量(FW)的A290nm改變0.01定義為一個酶活力單位U，用U/(g·h)表示。

1.2.3 PPO、POD酶液制備與活性測定

10g果肉中加入0.5g PVP，再加入20mL 0.2mol/L磷酸緩沖液(pH6.4)，冰浴勻漿，12000r/min 4℃離心20min，上清液用于酶活力測定。PPO活性測定參照Tian等[15]方法加以改進，在410nm波長處測定OD值的變化；POD活性測定參照田世平等[16]方法加以改進，在470nm波長處測定A470nm值的變化。PPO、POD活性均以每分鐘每克鮮質量(FW)的A470nm改變0.01定義為一個酶活力單位U，用U/(g·min)表示。

1.2.4 茶葉提取物對采后桃果實灰霉腐病的防止效果

桃果實按照上述方法進行處理后貯藏于25℃，分別于24、48、72、96h統計果實發病率和腐爛程度。每處理20個果實，重復3次。

1.3 數據處理與分析

實驗結果采用SPSS軟件中One-way ANOVA進行統計分析，Duncan氏多重比較進行差異顯著性檢驗，結果以“±s”表示，P＜0.05，表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 茶葉提取液對采后桃果PAL活性的影響

圖 1 茶葉提取液對打孔桃果PAL活性的影響Fig.1 Effect of tea extract on PAL activity of punched peach fruit

由圖1可知，桃果采后24h PAL活性略有降低，隨后隨放置時間的延長，PAL活性呈緩慢增加趨勢；打孔處理能明顯誘導桃果PAL活性的增強，且隨放置時間的延長，PAL活性呈先升后降趨勢；打孔＋茶葉提取液處理組PAL活性變化趨勢與打孔處理組相似，但與打孔處理組相比PAL活性明顯增強，說明茶葉提取液處理能明顯誘導打孔桃果PAL活性增強。

2.2 茶葉提取液與灰霉病菌聯合處理對采后桃果PAL活性的影響

由圖2可知，桃果打孔＋接種B. cinerea后PAL活性的變化趨勢與打孔處理相似，均呈先升后降趨勢，但在整個觀察過程中打孔＋接種B. cinerea組桃果PAL活性均高于打孔處理組，打孔＋接種病菌后24h與打孔處理組相比差異達顯著性水平，且打孔＋接種B. cinerea誘導PAL活性增強速度明顯快于打孔處理，接種后24h PAL活性就達到峰值，而打孔處理后48h PAL活性才達到峰值，這些研究結果表明接種病菌能迅速誘導PAL活性增強。

圖 2 茶葉提取液與灰霉病菌聯合處理對打孔桃果PAL活性的影響Fig.2 Effect of tea extract and B. cinerea on PAL activity of punched peach fruit

打孔＋接種病菌＋茶葉提取液處理組PAL活性變化趨勢與打孔＋接種病菌處理組一致，但茶葉提取液處理能進一步誘導PAL活性的增強，與打孔處理組、打孔＋接種病菌處理組相比差異均達顯著性水平(除接種后48h外)。

2.3 茶葉提取液對采后桃果PPO活性的影響

圖 3 茶葉提取液對打孔桃果PPO活性的變化Fig.3 Effect of tea extract on PPO activity of punched peach fruit

由圖3可知，桃果采后隨放置時間的延長，不打孔處理組、打孔處理組及打孔＋茶葉提取液處理組PPO活性均呈先升后降的趨勢。打孔處理能明顯誘導PPO活性的增強，打孔后72h內 PPO活性與不打孔處理組相比差異均達顯著性水平；茶葉提取液處理能進一步誘導打孔桃果PPO活性增強，在整個觀察過程中與打孔處理組相比差異均達顯著性水平，說明茶葉提取液處理能明顯誘導打孔桃果PPO活性增強。

2.4 茶葉提取液與灰霉病菌聯合處理對采后桃果PPO活性的影響

由圖4可知，桃果打孔＋接種B. cinerea、打孔＋接種B. cinerea＋茶葉提取液處理后PPO活性變化趨勢與打孔處理一致，均隨處理時間的延長先上升，48h后達到峰值，隨后又急劇下降。桃果接種病菌后能誘導PPO活性增強，但僅接種24h后與打孔處理組相比差異達顯著水平；茶葉提取液處理能進一步誘導接種病菌組桃果PPO活性增強，與打孔處理相比，接種24、72、96h差異達顯著水平，與打孔＋接種B. cinerea組相比，接種72、96h差異也達顯著水平。

圖 4 茶葉提取液與灰霉病菌聯合處理對打孔桃果PPO活性的變化Fig.4 Effect of tea extract and B. cinerea on PPO activity of punched peach fruit

2.5 茶葉提取液處理對采后桃果POD活性的影響

圖 5 茶葉提取液對打孔桃果POD活性的變化Fig.5 Effect of tea extract on POD activity of punched peach fruit

由圖5可知，桃果采后隨放置時間的延長POD活性呈先升后降的趨勢，48h達到峰值。打孔處理對桃果POD活性沒有明顯影響，而打孔＋茶葉提取液處理初期能顯著誘導POD活性上升，處理后24h POD活性與不打孔處理組、打孔處理組相比差異達顯著水平，隨后POD活性下降，與不打孔處理組、打孔處理組相比差異不顯著。

2.6 茶葉提取液與灰霉病菌聯合處理對采后桃果POD活性的影響

由圖6可知，桃果打孔＋接種B. cinerea及打孔＋接種B. cinerea＋茶葉提取液后POD活性變化趨勢與打孔處理一致，均呈先升后降的趨勢。打孔＋接種B. cinerea處理前期誘導POD活性急劇增強，處理24、48h后POD活性顯著高于打孔處理組，隨后迅速下降，POD活性顯著低于打孔處理組。茶葉提取液處理前期對接種病菌桃果POD活性無明顯影響，在處理后期可一定程度抑制接種病菌桃果POD活性降低，處理72、96h后POD活性顯著高于接種病菌組。

圖 6 茶葉提取液與灰霉病菌聯合處理對打孔桃果POD活性的變化Fig.6 Effect of tea extract and B. cinerea on POD activity of punched peach fruit

2.7 茶葉提取物對采后桃果灰霉病的防止效果

表 1 茶葉提取物對采后桃果灰霉腐病的防止效果Table 1 Effect of tea extract against Botrytis cinerea of postharvest peach fruit

雖然沒打孔組桃果經4d貯藏后均沒有發病，但打孔組桃果第2天開始感病，且與沒打孔組桃果相比差異達顯著水平；打孔＋接種病菌組桃果第1天開始感病，且感病率高達100%，與打孔組桃果相比差異達極顯著水平，說明該桃果感病性較強。茶葉提取物處理不僅能顯著減少打孔組桃果發病率與病斑直徑(P＜0.05)，也能顯著減少打孔＋接種病菌組桃果發病率與病斑直徑(P＜0.05)，表明茶葉提取物能有效提高桃果抗病性，這與茶葉提取物能誘導桃果抗性酶活性一致。

3 討 論

植物誘導抗性是植物受到外界物理、化學或者生物等因素侵襲時所產生的一種獲得性抗性，使植物獲得抵御病害的能力，從而杜絕或減少化學藥品的使用。植物抗性的誘導主要表現為木質素的產生、植保素的合成與積累、抗性酶活性增強及抗性蛋白的產生，其中植物在抵御機械損傷或病原微生物侵染過程中，PAL、PPO、POD等抗性酶發揮了重要作用。PAL是苯丙烷類物質代謝途徑的的第一關鍵酶，與木質素、植保素及酚類化合物等抗性物質的形成密切相關[17]。PPO是引起果實褐變的主要因素[18]，但在植物抗病反應中也發揮著重要作用。PPO通過催化木質素及酚類氧化產物的形成，構成保護性屏蔽而使細胞免受病菌的侵害，也可通過醌類化合物的形成直接發揮抗病作用[19]。POD在植物抵抗病原菌中也發揮重要作用，主要在木質素生物合成的最后一步反應過程中催化H2O2分解而發揮作用[20]。

本實驗結果表明，桃果機械損傷后PAL、PPO活性顯著增強，機械損傷后桃果接種灰霉病菌不僅會進一步誘導PAL、PPO活性增強，還能誘導POD活性增強，接種病菌后24h桃果PAL、PPO、POD活性與沒打孔組、打孔組桃果相比差異均達顯著水平。茶葉提取液處理不僅能誘導機械損傷組桃果PAL、PPO、POD活性增加，與打孔組相比，處理后24h差異均達顯著水平，也能誘導接種病原菌組桃果PAL、PPO活性增強。這些研究結果表明在抵御機械損傷或接種病原菌引起的桃果感病過程中PAL、PPO、POD發揮了重要作用。桃果在機械損傷或接種病原菌后PAL、PPO、POD活性增加過程中，桃果開始感病，但茶葉提取液處理能減緩機械損傷桃果的發病率及發病程度，也能明顯減少病原菌侵染桃果病斑直徑，說明茶葉提取液發揮防腐保鮮效果是通過誘導桃果PAL、PPO、POD活性增強而實現的。

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