四川部分地區(qū)豬肉產(chǎn)業(yè)鏈中沙門氏菌的分離及其鑒定

侯小剛，劉書亮,*，韓新鋒，吳聰明

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100193)

沙門氏菌是公共衛(wèi)生學(xué)上有重要意義的一種常見的人畜共患病原菌，血清型有2463個(gè)，我國共檢出287個(gè)[1]。由于環(huán)境和宿主的不同，其血清型呈明顯的地域性差異[2-6]。

近年來，沙門氏菌大規(guī)模污染食品并引起食物中毒的事件時(shí)有發(fā)生[7-8]。動(dòng)物性食品是沙門氏菌污染的主要對象，動(dòng)物生前以及后續(xù)的屠宰加工、運(yùn)輸、貯藏和銷售等環(huán)節(jié)都容易污染和傳播沙門氏菌。豬肉是我國廣大居民的主要?jiǎng)游镄允称分唬瑢?shí)時(shí)監(jiān)測豬肉產(chǎn)業(yè)鏈(包括養(yǎng)殖場、屠宰場和銷售市場)中沙門氏菌的污染和傳播情況對確保豬肉安全具有重要意義。目前，對豬肉產(chǎn)業(yè)鏈單個(gè)環(huán)節(jié)中沙門氏菌污染的調(diào)查已有較多報(bào)道[2,4,9]，但從豬肉產(chǎn)業(yè)鏈的整體角度，對沙門氏菌污染的調(diào)查報(bào)道較少。傳統(tǒng)的細(xì)菌分離鑒定費(fèi)時(shí)費(fèi)力，靈敏度差，而PCR方法以其快速靈敏、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌檢測中，其中，針對invA基因[10]和hut基因[11]作為靶基因的PCR方法檢測沙門氏菌已得到普遍認(rèn)可[12-15]。

本研究旨在對四川省部分地區(qū)豬肉產(chǎn)業(yè)鏈主要環(huán)節(jié)中沙門氏菌進(jìn)行分離鑒定和血清型分析，了解優(yōu)勢血清型的分布與傳播，為豬肉安全生產(chǎn)和沙門氏菌食物中毒的防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2010—2011年期間，自四川部分地區(qū)的大型養(yǎng)豬場、下游生豬屠宰場和肉類市場采集樣品，其中養(yǎng)殖場取育肥豬糞便樣、屠宰場取豬胴體分割肉樣、肉類市場購買零售肉樣。

氯化鎂孔雀綠(MM)增菌液、亞硒酸鹽胱氨酸(SC)增菌液、膽硫乳(DHL)瓊脂、營養(yǎng)肉湯均 杭州微生物有限公司；沙門氏菌顯色培養(yǎng)基(法國科瑪嘉) 鄭州博賽生物技術(shù)股份有限公司；DL 2000 DNA Marker、PCR反應(yīng)試劑 寶生物工程(大連)有限公司；GoldviewTM核酸染料 天根生化科技有限公司；沙門氏菌屬診斷血清(60種) 寧波天潤生物藥業(yè)有限公司；其余試劑為分析純或生化試劑。

1.2 參考菌株

腸炎沙門氏菌CICC21482為陽性對照菌株，大腸桿菌ATCC25922為陰性對照菌株，均由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 引物

根據(jù)文獻(xiàn)[10-11]針對沙門氏菌invA基因和hut基因設(shè)計(jì)兩對引物(表1)，由寶生物工程(大連)有限公司合成。

表 1 靶基因名稱及引物序列Table 1 Target gene and primer sequences

1.4 儀器與設(shè)備

Scientz-04無菌均質(zhì)器 寧波新芝生物科技股份有限公司；Sorvall離心機(jī) 美國科俊儀器有限公司；Milli-Q超純水系統(tǒng) 美國Millipore公司；MyCycler PCR儀、PowerPac Basic電泳儀、水平電泳槽、凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司。

1.5 方法

1.5.1 樣品采集

在豬肉生產(chǎn)加工銷售的3個(gè)主要環(huán)節(jié)(即養(yǎng)殖-屠宰加工-銷售)分別取樣。養(yǎng)豬場，隨機(jī)采集育肥豬肛拭糞樣置于無菌運(yùn)送培養(yǎng)基中；生豬屠宰場，隨機(jī)抽取胴體分割車間肉樣，每份250g左右裝到無菌保鮮袋內(nèi)；豬肉市場，各攤販點(diǎn)購買零售豬肉，每份250g左右裝到無菌保鮮袋內(nèi)。所有樣品均低溫保存運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，待檢。

1.5.2 沙門氏菌的分離

無菌條件下，將肛拭糞樣約1g分別置于10mL無菌MM增菌液和SC增菌液中混勻，分別在42℃(MM增菌液)和37℃(SC增菌液)條件下培養(yǎng)18～24h；將豬肉樣品放在一次性無菌均質(zhì)袋內(nèi)用均質(zhì)器拍打成勻漿，取25g加入225mL無菌水，充分混勻10min，各取1mL浸洗液分別接種于10mL MM增菌液和SC增菌液中混勻，然后分別在42℃(MM增菌液)和37℃(SC增菌液)條件下培養(yǎng)18～24h。將增菌培養(yǎng)液劃線接種于DHL瓊脂平板和沙門氏菌顯色(法國科瑪嘉)平板進(jìn)行分離純化，篩選出疑似沙門氏菌菌株。

1.5.3 沙門氏菌分離株的二重PCR鑒定

1.5.3.1 細(xì)菌DNA的提取

采用熱裂解法[15-16]提取細(xì)菌DNA：平板上挑取單個(gè)疑似沙門氏菌菌落接種于5mL滅菌營養(yǎng)肉湯中37℃培養(yǎng)18～20h，取培養(yǎng)液1.5mL，10000r/min離心1min，取沉淀，用1mL滅菌超純水重復(fù)洗兩次；10000r/min離心1min，取沉淀，加100μL TE(pH8.0)溶液，重懸細(xì)胞，98℃水浴10min，再于冰上放置5min；12000r/min離心1min，取上清液，即為細(xì)菌DNA，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.3.2 PCR擴(kuò)增

根據(jù)文獻(xiàn)[12]和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，兩對引物invA與hut濃度比例為1：3，PCR反應(yīng)體系包括：10×PCR Buffer 2.5μL、MgCl2(25mmol/L)1.5μL、dNTP 2μL，invA基因和hut基因上下游引物終濃度分別是0.2μmol/L和0.6μmol/L，模板DNA 2μL，補(bǔ)雙蒸水至最終體積25μL。PCR反應(yīng)程序[16]為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性40s，60℃退火40s，72℃延伸50s，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min，于4℃保存。

1.5.3.3 PCR產(chǎn)物的電泳檢測

將PCR產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖(0.5×TBE)凝膠電泳后，凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果，能擴(kuò)增出invA基因和hut基因特異性片段的菌株，即為沙門氏菌陽性菌株[12]。

1.5.4 沙門氏菌的血清分型

參考食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB4789.4—2010《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌檢驗(yàn)》[17]中的方法，用沙門氏菌屬診斷血清(60種)對沙門氏菌分離株進(jìn)行血清分型。

2 結(jié)果與分析

2.1 疑似沙門氏菌分離結(jié)果

829份樣品通過選擇性培養(yǎng)基篩選得到疑似沙門氏菌陽性樣品116份。

2.2 疑似沙門氏菌的二重PCR產(chǎn)物鑒定結(jié)果

采用參考菌株和空白實(shí)驗(yàn)對所設(shè)計(jì)的兩對引物進(jìn)行特異性驗(yàn)證，結(jié)果表明腸炎沙門氏菌CICC21482擴(kuò)增出兩條目的片段，其余對照均未擴(kuò)增出任一目的片段，說明所設(shè)計(jì)的兩對引物特異性可靠。

從不同樣品中檢出的116株疑似沙門氏菌的二重PCR產(chǎn)物的部分電泳結(jié)果如圖1所示。同時(shí)擴(kuò)增出invA基因和hut基因的特異性片段(284bp和495bp)的疑似菌株(如圖1中條帶1～5、8～12)共有112株，判斷為沙門氏菌陽性[12]，其余4株疑似沙門氏菌均未擴(kuò)增出任一目的片段(如圖1中條帶6、7)，判斷為沙門氏菌陰性。由此得出，所采集的樣品有112份呈沙門氏菌陽性。

圖 1 部分疑似沙門氏菌二重PCR產(chǎn)物的電泳圖Fig.1 Electrophoresis of duplex PCR amplified products from suspected Salmonella

2.3 四川部分地區(qū)豬肉產(chǎn)業(yè)鏈中沙門氏菌的污染情況

表 2 四川部分地區(qū)豬肉產(chǎn)業(yè)鏈中沙門氏菌的污染率Table 2 Percentage of Salmonella contimination from pork industry chains in partial areas of Sichuan province

四川部分地區(qū)豬肉產(chǎn)業(yè)鏈中沙門氏菌的污染情況見表2。養(yǎng)殖場育肥豬沙門氏菌污染率最高，達(dá)到16.40%(71/433)，而生豬屠宰場和豬肉市場的豬肉樣品沙門氏菌污染率分別是10.71%(21/196)和10.00%(20/200)。

2.4 四川部分地區(qū)豬肉產(chǎn)業(yè)鏈中沙門氏菌的血清型分布情況

112株沙門氏菌的血清鑒定結(jié)果見表3，共有102株沙門氏菌被定型，可分為11種血清型；另有10株未定型沙門氏菌菌株不自凝，且均與沙門氏菌屬診斷血清O多價(jià)(A～F)呈陽性反應(yīng)，具體血清型種類還有待采用更多的血清因子進(jìn)一步確定。已定型的沙門氏菌：德爾卑沙門氏菌占58.04%(65/112)，鼠傷寒沙門氏菌占12.50%(14/112)，波茨坦沙門氏菌占6.25%(7/112)，其余血清型占少數(shù)。養(yǎng)殖場育肥豬中檢出的沙門氏菌共分為7種血清型，其中德爾卑沙門氏菌占63.38%(45/71)，鼠傷寒沙門氏菌占16.90%(12/71)，波茨坦沙門氏菌占5.63%(4/71)，其余血清型占少數(shù)；生豬屠宰場豬肉中檢出的沙門氏菌共分為4種血清型，其中德爾卑沙門氏菌占61.90%(13/21)，鼠傷寒沙門氏菌和吉韋沙門氏菌各占9.52%(2/21)，茨昂威沙門氏菌占4.76%(1/21)，另有3株未分型；銷售市場豬肉中檢出沙門氏菌共有6種血清型，其中德爾卑沙門氏菌占35.00%(7/20)，波茨坦沙門氏菌和吉韋沙門氏菌各占15.00%(3/20)，圣保羅沙門氏菌和豬霍亂或丙型副傷寒沙門氏菌各占10.00%(2/20)，鴨沙門氏菌占5.00%(1/20)，另有兩株未分型。

表 3 四川部分地區(qū)豬肉產(chǎn)業(yè)鏈中沙門氏菌的血清型分布情況Table 3 Serotype distribution of Salmonella from pork industry chains in partial areas of Sichuan province

2.5 四川部分地區(qū)豬肉產(chǎn)業(yè)鏈中沙門氏菌血清群的分布情況

表 4 四川部分地區(qū)豬肉產(chǎn)業(yè)鏈中沙門氏菌血清群的分布Table 4 Serogroup distribution of Salmonella from pork industry chains in partial areas of Sichuan province

由表4可知，四川部分地區(qū)豬肉產(chǎn)業(yè)鏈中沙門氏菌血清型分布在B、C、E群，而產(chǎn)業(yè)鏈各個(gè)環(huán)節(jié)沙門氏菌都以B群為優(yōu)勢血清群，但是在市場豬肉中，B群沙門氏菌所占的比例(9/18)明顯低于養(yǎng)殖場育肥豬和屠宰場豬肉中B群沙門氏菌所占的比例(58/66、15/18)。

3 討 論

目前，沙門氏菌的檢測方法主要有傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)方法、PCR方法和免疫學(xué)方法。免疫學(xué)方法雖然準(zhǔn)確，但成本較高、靈敏度較低；傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)方法費(fèi)時(shí)、操作繁瑣，難以應(yīng)對大規(guī)模樣品中沙門氏菌的快速檢測[18-19]；而PCR方法快速、靈敏、準(zhǔn)確。本研究檢測沙門氏菌采用的是傳統(tǒng)方法分離、PCR方法鑒定的方式，實(shí)現(xiàn)了快速準(zhǔn)確從大批量樣品中收集沙門氏菌的目的。根據(jù)invA基因和hut基因設(shè)計(jì)的兩對引物鑒定沙門氏菌分離株的結(jié)果與血清學(xué)結(jié)果一致，說明這兩個(gè)特異性基因在檢測沙門氏菌時(shí)可靠，與文獻(xiàn)[12-15]等的結(jié)論相符。

從本研究的結(jié)果來看，在所涉及地區(qū)豬肉產(chǎn)業(yè)鏈中沙門氏菌的污染率比較高，而不同的采樣環(huán)節(jié)污染率有一定差異。養(yǎng)殖場育肥豬沙門氏菌污染率最高，達(dá)到了16.40%，而張瑋[9]對安徽部分豬場生豬調(diào)查的結(jié)果表明沙門氏菌檢出率總體達(dá)到4.07%，其中安慶地區(qū)豬場檢出率達(dá)到18.89%，說明不同采樣點(diǎn)生豬沙門氏菌檢出率差異明顯。屠宰場和銷售市場豬肉沙門氏菌污染率相近，分別為10.71%和10.00%，都遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于某些報(bào)道中的74.6%[20]，而張靜等[21]對某定點(diǎn)生豬屠宰場的研究中指出生豬胴體體表和肉樣沙門氏菌檢出率分別為5%和0%，席昭雁等[22]在對陜西食品的調(diào)查中指出生豬肉中沙門氏菌的檢出率達(dá)到19.10%。本研究中所采集生豬肉樣大部分來自衛(wèi)生條件不規(guī)范的屠宰場和市場，其中多個(gè)環(huán)節(jié)冷鏈系統(tǒng)不夠完備，加之相關(guān)從業(yè)人員疏忽和來自環(huán)境的污染，造成了所采生肉樣品沙門氏菌的污染率較高。可見，在豬肉屠宰場和銷售市場，不同的衛(wèi)生條件下沙門氏菌的污染率差異很大，衛(wèi)生條件嚴(yán)格的情況下沙門氏菌污染率很低甚至可以達(dá)到零污染，衛(wèi)生條件不規(guī)范的情況下容易出現(xiàn)沙門氏菌大規(guī)模污染食品。

從本研究中沙門氏菌的血清型統(tǒng)計(jì)結(jié)果看，所涉及地區(qū)豬肉產(chǎn)業(yè)鏈中沙門氏菌分離株以德爾卑沙門氏菌為優(yōu)勢血清型，與楊保偉等[2]的研究結(jié)果一致，而在國內(nèi)其他的相關(guān)研究報(bào)道中，有以腸炎沙門氏菌占優(yōu)勢[23]，也有以鼠傷寒沙門氏菌占優(yōu)勢[24]，表明沙門氏菌優(yōu)勢菌血清型的分布存在很大的區(qū)域性差異。本研究中德爾卑沙門氏菌雖然在各產(chǎn)業(yè)鏈中均占優(yōu)勢，但隨著產(chǎn)業(yè)鏈條的遞進(jìn)(養(yǎng)殖場-屠宰場-銷售市場)，優(yōu)勢血清型在各產(chǎn)業(yè)鏈條中所占比例有所下降，漸變過程為63.38%、61.90%、35.00%，與此同時(shí)在上游產(chǎn)業(yè)鏈中占劣勢的血清型到下游產(chǎn)業(yè)鏈中其比例有所上升；另外，某些在上游產(chǎn)業(yè)鏈中檢出的血清型在下游產(chǎn)業(yè)鏈中并未檢出，而有些在上游產(chǎn)業(yè)鏈中并未檢出的血清型卻出現(xiàn)在下游產(chǎn)業(yè)鏈中。說明沙門氏菌在本研究所涉及地區(qū)豬肉產(chǎn)業(yè)鏈中主要以垂直傳播的途徑污染生豬，即多數(shù)沙門氏菌來源于生豬本身，同時(shí)在產(chǎn)業(yè)鏈下游環(huán)節(jié)中外源性沙門氏菌又進(jìn)一步污染生豬肉。

四川部分地區(qū)豬肉產(chǎn)業(yè)鏈中沙門氏菌污染情況不容樂觀，并且產(chǎn)業(yè)鏈上游環(huán)節(jié)中沙門氏菌向產(chǎn)業(yè)鏈下游環(huán)節(jié)垂直傳播；生豬屠宰場和銷售市場衛(wèi)生規(guī)范執(zhí)行不嚴(yán)格，導(dǎo)致加工、銷售中的生豬肉再次感染沙門氏菌。因此，需要政府及相關(guān)部門加強(qiáng)對豬肉產(chǎn)業(yè)鏈的生產(chǎn)衛(wèi)生監(jiān)督，確保衛(wèi)生措施有效執(zhí)行。

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