長壽命熒光探針在飲用水中病原微生物檢測前景①

摘 要：飲用水中微生物污染不斷出現(xiàn)，對檢測技術(shù)提出了新的挑戰(zhàn)。作者介紹了目前飲用水中病原微生物的種類、危害及我國飲用水微生物指標，對病原微生物的檢測方法進行了歸納，探討了長壽命熒光探針技術(shù)在飲用水中病原微生物檢測的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：長壽命熒光探針 飲用水 病原微生物

中圖分類號：X835 文獻標識碼：A 文章編號：1672-3791（2013）07（c）-0132-01

環(huán)境水體的污染，直接影響著飲用水的質(zhì)量，隨著水體生物污染的出現(xiàn)，給飲用水的安全問題提出了新的挑戰(zhàn)。飲用水中微生物，特別是病原體微生物的出現(xiàn)，給人類的生命安全帶了隱患，如2003年SARS冠狀病毒[1]等全球性生物污染的出現(xiàn)，使飲用水中病原微生物的檢測成為全球關(guān)注的熱點。

1 飲用水中常見的病原微生物

飲用水中有許多微生物，絕大部分微生物都是無害的，引起安全問題的主要是致病微生物，主要包括細菌、病毒、藻類、原生動物。細菌中常見的主要有傷寒桿菌、軍團菌、病原性大腸桿菌、鳥分歧桿菌復合群、螺桿菌、彎曲桿菌、霍亂桿菌等。常見病毒有腸道病毒、肝炎病毒、輪狀病毒、兔杯狀病毒等。有些藻類能產(chǎn)生肝毒素、神經(jīng)毒素等，特別是研究發(fā)現(xiàn)飲用水中微囊藻毒素與肝癌發(fā)病率高度相關(guān)。原生動物主要有賈第鞭毛蟲、隱孢子蟲、環(huán)孢子蟲和微孢子蟲，它們能引起人的腹瀉、嘔吐等癥狀，嚴重者可出現(xiàn)生命危險。

2 我國的飲用水微生物指標

目前，世界各國無論是發(fā)達國家還是發(fā)展中國家，都把飲用水中微生物問題列在首位[2]。也制定了相關(guān)飲用水中微生物的指標：總的來說，發(fā)達國家的指標中微生物的種類要更多，要求更嚴格。這也是飲用水中微生物指標的發(fā)展趨勢。中國目前以2006年頒布的《生活飲用水衛(wèi)生標準》，共6項微生物指標，包括微生物項目細菌總數(shù)、大腸桿菌、賈第鞭毛蟲、隱孢子蟲、大腸埃希菌和耐熱大腸菌群?？梢钥吹?，我國對病毒和產(chǎn)毒藻類并沒有強制的標準，需要在不斷的發(fā)展中修訂我國的飲用水水質(zhì)標準。

3 飲用水中微生物檢測方法

隨著飲用水中微生物指標地不斷修訂，飲用水中微生物的標準檢測方法也在不斷的更新發(fā)展[3]。國家標準中規(guī)定的檢測方法主要包括：菌落總數(shù)的平板計數(shù)法，總大腸桿菌和大腸埃希氏菌的多管發(fā)酵法、濾膜法、酶底物法，耐熱大腸菌群的多管發(fā)酵法、濾膜法，賈第鞭毛蟲和隱孢子蟲的分子生物學方法。細菌的傳統(tǒng)的形態(tài)學檢測方法被一度認為是經(jīng)典的微生物檢測方法，在我國也一直沿用至今，該方法成本低、對實驗室的硬件要求也不高，但是這種方法費時，而且對檢測人員的要求也比較高。對于原生生物的檢測也存在著方法操作復雜、檢出率低、價格昂貴等缺點。

免疫學技術(shù)特別是酶聯(lián)免疫吸附測定已經(jīng)成功地用來檢測甲型肝炎病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒等，相關(guān)的檢測試劑盒也已經(jīng)商業(yè)化。免疫學技術(shù)比傳統(tǒng)的方法在時間上縮短了很多，但是也存在一些不足：抗體制作困難，結(jié)果受到洗滌、抗原包被過程的影響很大；另外，針對變異性快的病毒，免疫學檢測就比較困難，抗體容易失效，不能檢測新的抗原。

分子生物學的發(fā)展，是人們對微生物的檢測也發(fā)展到了分子水平。主要出現(xiàn)了聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）技術(shù)、熒光原位雜交（FISH）技術(shù)和基因芯片技術(shù)。PCR技術(shù)由于其高靈敏度和特異性等特點得到了廣泛的應(yīng)用，也衍生出了多種檢測方法，包括熒光定量PCR、免疫PCR等。PCR反應(yīng)容易受到環(huán)境中一些物質(zhì)的干擾而出現(xiàn)假陽性結(jié)果，并且需要得到純化的DNA或RNA片段進行擴增，步驟多，儀器昂貴，對操作人員的要求也高。FISH技術(shù)是一種安全、快速、靈敏度較高的技術(shù)，但成本較高，難以普及應(yīng)用?；蛐酒夹g(shù)起步較晚，還不是很完善，在特異性、樣品制備等方面還存在許多問題，而且成本也比較高。這些方法還容易受到生物體系內(nèi)源熒光背景和固體基質(zhì)背景的干擾，檢測時靈敏度的提高受到限制。

另外，還出現(xiàn)了流式細胞術(shù)等檢測新技術(shù)[4]，該技術(shù)縮短了檢測時間，而且能區(qū)分活性和非活性細菌，以及估算微生物的再生能力。但是也存在一定的假陽性和假陰性率，并且使用不同熒光染料或者內(nèi)標進行檢測，結(jié)果也明顯有差異，檢測費用也比較昂貴。

4 長壽命熒光標記技術(shù)

熒光分析法是一種先進的分析方法，具有儀器構(gòu)造簡單、靈敏度高、選擇性好等優(yōu)點而不斷地被應(yīng)用在各種分析檢驗過程中?；跓晒夥治鲈淼臒晒馓结樇夹g(shù)在生命科學等領(lǐng)域已經(jīng)起著舉足輕重的作用，由于其在檢測速度和易用性方面具有無可比擬的優(yōu)點，在很多方面已經(jīng)取代放射性核素標記技術(shù)而稱為標準的方法。但是熒光標記法有個最大的問題就是熒光探針容易受到生物體內(nèi)源熒光和固體基質(zhì)背景熒光的干擾。

長壽命熒光技術(shù)可以利用時間分辨的方法來消除內(nèi)源熒光和干擾熒光，引起了國內(nèi)外學者的關(guān)注而迅速發(fā)展。從20世紀80年代起，已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學診斷、食品安全監(jiān)測等領(lǐng)域。在微生物檢測方面，長壽命熒光標記技術(shù)也嶄露頭角，已用于快速測定食品中的大腸桿菌、微囊藻毒素、赭曲霉素A。Niu等以功能性長壽命稀土銪配合物為標記物，以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為例，建立了基于固體基質(zhì)表面的雙探針串聯(lián)雜交模型，用于病原微生物DNA的檢測，并成功地對環(huán)境樣品中病源微生物進行了測定。將長壽命熒光探針技術(shù)構(gòu)建高穩(wěn)定性、高靈敏度、快速、簡便的飲用水中病原微生物的檢測具有重要的理論與實際意義。

參考文獻

[1]Wang Zijian，He Xiaoqing，Xie Xiang ming.Molecular technologies for monitoring pathogens in drinking water[J].J Ecotech Res，2004（10）：113-118.

[2]王中衛(wèi)，李哲民.中外飲用水水質(zhì)標準的微生物指標比較[J].環(huán)境監(jiān)測管理與技術(shù)，2012，24（1）：70-74.

[3]金銀龍.GB 5749-2006生活飲用水衛(wèi)生標準釋義[S].北京：中國標準出版社，2007：155.

[4]余輝，馬麗麗，毛冠男，等.飲用水微生物的安全快速檢測[J].微生物學通報，2012，39（8）：1171-1178.