小立碗蘚細胞色素P450基因PpCYP51G1的分離及轉化載體構建

摘 要：從小立碗蘚（Physcomitrella patens）中克隆了細胞色素P450 CYP51基因PpCYP51G1的全長編碼序列，編碼區長1 509 bp，預測編碼488個氨基酸，蛋白二級結構含有自由卷曲、伸展片段和α-螺旋，N端含有一個跨膜區域。構建了PpCYP51G1的功能缺失載體，并利用PEG介導的原生質體轉化技術獲得該基因的功能缺失轉化體；同時，構建了PpCYP51G1-GFP融合蛋白載體，亞細胞定位結果表明，PpCYP51G1定位在內質網中。

關鍵詞：小立碗蘚；細胞色素P450；CYP51；克隆；轉化載體構建

中圖分類號：Q781 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2013）10-0001-07

CYP51為甾醇14α-去甲基化酶（又稱P45014DM），被視為最古老的細胞色素P450家族成員^[1]，是細胞色素P450家族中唯一一個在真菌、植物和動物界都具有保守功能的成員^[2]。真菌CYP51是真菌麥角甾醇合成過程的關鍵酶，抑制其活性將會阻礙麥角甾醇的合成，破壞細胞膜的結構和功能，最終導致真菌死亡。目前農業上CYP51抑制劑（14α-demethylation inhibitors，DMIs）類殺菌劑即是通過抑制真菌CYP51的活性發揮殺菌抑菌作用^[3]。植物CYP51不僅參與植物體的基礎代謝，還參與植物體的次生代謝，主要表現在次生代謝物質的合成及降解化學藥物毒性兩方面，其催化的代謝途徑可產生一些重要次生代謝物， 提高植物抵抗病蟲害及逆境脅迫的能力^[4]。因此，研究CYP51對于研究細胞色素P450的結構、功能和進化具有重要意義。

小立碗蘚（Physcomitrella patens）是目前發現的唯一具有高頻率同源重組的植物^[5]。同源重組是基因打靶的技術核心。Kammerer^[6]和Cove^[7]等首先在小立碗蘚中實現了基因同源重組。隨后Schaefer等^[8，9]進一步證實小立碗蘚基因打靶效率高達90%，與酵母基因打靶頻率（95%）相當，這是高等植物中通過同源重組進行精確基因打靶的先例。目前，基因打靶技術已成為研究小立碗蘚基因功能的有效工具^[10～13]。由于生活周期短、易于培養、轉基因植株易于分析以及核基因組易于和外源DNA發生同源重組等特點，小立碗蘚已成為重要的植物分子生物學研究材料。本試驗克隆了小立碗蘚細胞色素P450 CYP51基因PpCYP51G1，并試圖利用其高頻率同源重組特性獲得該基因的功能缺失突變體并通過亞細胞定位研究其功能。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小立碗蘚Gransden品系Physcomitrella patens （Hedw.） B.S.G由Ralf Reski 教授惠贈。

試驗所用試劑：pCAMBIA-1301載體、連有GFP的PJIT163質粒由本實驗室保存；大腸桿菌菌種（DH5α）、BioFlux膠回收試劑盒（3S Spin DNA Agarose Gel Purification Kit）購自山東濟南朋遠公司；Taq 酶、Ex Taq酶、T4 DNA連接酶、限制性內切酶、dNTP購自TaKaRa公司；pGEM-T easy vector System購自美國Promega公司；引物由北京博尚生物技術有限公司合成；Trizol購自Invitrogen公司；反轉錄試劑盒（First-Strand cDNA Synthesis Kit）購自上海申能博彩生物科技有限公司；測序由山東省農業科學院高新技術研究中心測序室完成。

1.2 試驗方法

1.2.1 PpCYP51G1全長cDNA編碼序列的克隆 采用Trizol法提取小立碗蘚原絲體總RNA，利用反轉錄試劑盒（First-Strand cDNA Synthesis Kit）反轉錄合成cDNA第一條鏈。以小立碗蘚反轉錄產物為模板，利用特異性引物PCYP51G1F：5′- GATACAATGGGGGATGCGGA-3′和PCYP51G1R：5′-ATCACATGTCAGTTGACGAC- 3′進行PCR，獲得PpCYP51G1的全長編碼序列。

1.2.2 PpCYP51G1氨基酸序列特征分析和二級結構預測 在http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi網站利用Blast工具進行序列相似性分析；利用DNAMAN軟件預測其編碼蛋白并進行蛋白序列比對、系統進化樹構建；利用GOR軟件（http：//www.expasy.ch/tools/） 對其蛋白二級結構進行預測；使用TMHMM軟件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）對其蛋白跨膜結構進行預測。

1.2.3 PpCYP51G1功能缺失載體的構建、轉化及轉化體的篩選和鑒定 以基因組DNA為模板，利用引物PCYP51G1F和PCYP51G1R進行PCR擴增，得到長度大于1 kb的DNA片段，克隆測序，分析測序結果找出外顯子區域及內含子區域，并將基因打靶位點設計在外顯子區域，取打靶位點前后各約500 bp的片段，分別命名為Ⅰ片段、Ⅱ片段。擴增PpCYP51G1的Ⅰ片段和Ⅱ片段所用引物分別為：

CYP51G1F1：5′-GACGTCGATTCTCCCGACTGGGTGAG-3′（劃線處為Aat Ⅱ 酶切位點）

CYP51G1R1：5′-GAATTCAGAACGAAGTGACCCACAAT-3′（劃線處為EcoR Ⅰ 酶切位點）

CYP51G1F2：5′-ACTAGTCGCGTGGAATCGGAAGCGAC-3′ （劃線處為Spe Ⅰ 酶切位點）

CYP51G1R2：5′-GAGCTCGCTGCAAAGCAAAACCCCGA-3′ （劃線處為Sac Ⅰ 酶切位點）

pCAMBIA-1301載體（GenBank登陸號為AF234297.1）中帶有雙CaMV 35S啟動子、潮霉素磷酸轉移酶基因（hpt Ⅱ）及CaMV 3′UTR區的片段命名為Ⅲ片段（即pCAMBIA-1301載體上8 720～10 795 bp之間的片段），片段大小為2 076 bp，擴增引物如下：

hpt-F：5′-AGCTTGCCAACATGGTGGAGCAC-3′

hpt-R：5′-AATTCGGGGGATCTGGATTTTAGTAC-3′

分別將Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ片段克隆到pGEM-T easy 載體上，轉化大腸桿菌感受態細胞，經測序鑒定后，提取質粒。首先用Spe Ⅰ和Sac Ⅰ分別雙酶切連有Ⅱ和Ⅲ片段的質粒（Ⅲ片段兩端的酶切位點為pGEM-T easy 載體自帶酶切位點），回收Ⅱ片段和連有Ⅲ片段的線性化質粒，將二者連接后轉化大腸桿菌感受態細胞，挑取陽性克隆，經測序鑒定后提取質粒。再用Aat Ⅱ和EcoR Ⅰ雙酶切質粒（pGEM-T easy 載體自帶酶切位點），同時用Aat Ⅱ和EcoRⅠ雙酶切連有Ⅰ片段的質粒，將回收的Ⅰ片段與同時連有Ⅱ和Ⅲ片段的線性化質粒連接，轉化大腸桿菌感受態細胞，挑取陽性克隆進行PCR、酶切及測序鑒定，鑒定正確的即為我們需要的PpCYP51G1功能缺失載體。

以該載體為模板，以CYP51G1F1和CYP51G1R2為引物進行PCR擴增，回收目的片段，用PEG介導的原生質體轉化方法轉化小立碗蘚原生質體。小立碗蘚原生質體的制備、PEG介導的原生質體轉化、再生和轉基因植株的篩選參考王鳳德等^[14]的方法。

取選擇性培養基上生長的抗性植株及野生型植株，分別提取其DNA，以抗性植株DNA、野生型植株DNA以及構建的質粒載體為模板，用引物hpt-F和hpt-R進行PCR擴增，鑒定陽性植株。

1.2.4 PpCYP51G1-GFP融合蛋白載體的構建、轉化及亞細胞定位 設計帶有BamH Ⅰ酶切位點的引物擴增PpCYP51G1基因，所用引物為：CYP51G1-F：5′-GTGGATCCGATACAATGGGGGATGCGGA-3′和CYP51G1-R：5′-GTGGATCCATCACATGTCAGTTGACGAC-3′（劃線處為BamH Ⅰ酶切位點），將擴增得到的目的片段通過BamH Ⅰ酶切位點連接到PJIT163質粒載體上，轉化大腸桿菌感受態細胞，挑取陽性克隆，進行酶切及測序鑒定，插入方向正確的質粒用PEG介導的轉化方法轉化小立碗蘚原生質體^[14]。

將轉化后的原生質體25℃黑暗過夜培養，熒光顯微鏡下觀察GFP熒光的分布。

2 結果與分析

2.1 PpCYP51G1基因的克隆

以小立碗蘚反轉錄產物為模板，利用特異性引物PCYP51G1F和PCYP51G1R進行PCR擴增，得到一條約為1.5 kb 的帶（圖1）。測序結果顯示，該基因的編碼區長1 509 bp，預測編碼488個氨基酸（圖2）；序列比對發現，其氨基酸序列與擬南芥CYP51G1基因AtCYP51G1（GenBank登錄號為NM_101040）的編碼蛋白序列的一致性為65%，命名為PpCYP51G1。Blast 檢索發現基因組測序已經完成的細菌、真菌和動物中都有PpCYP51G1基因的同源基因。

2.2 PpCYP51G1氨基酸序列特征分析和二級結構預測

2.2.1 PpCYP51G1氨基酸序列同源性分析 對小立碗蘚、擬南芥、水稻、衣藻、酵母CYP51G1基因編碼的氨基酸序列進行比對（圖3）并構建系統進化樹（圖4），結果表明，PpCYP51G1與擬南芥、水稻、衣藻、酵母CYP51G1的氨基酸序列一致性分別為65%、64%、50%、28%。

2.2.2 PpCYP51G1二級結構預測 利用GOR軟件（http：//www.expasy.ch/tools/） 預測了PpCYP51G1的二級結構，如圖5所示，自由卷曲（random coil）占41.04%，伸展片段（extended strand）占16.46%，α-螺旋（alpha helix）占42.50%。對PpCYP51G1蛋白序列進行了跨膜結構預測， 結果發現其N端具有一個跨膜區（圖6A）。為確定跨膜區的長度，逐個截短N端序列，當截短了22個氨基酸時， N 端沒有跨膜區（圖6B），說明跨膜區至少包括N端的22個氨基酸序列。

2.3 PpCYP51G1功能缺失載體鑒定

分別用Ⅰ片段兩個引物、Ⅱ片段兩個引物以及Ⅰ片段5′端引物/Ⅱ片段3′端引物進行擴增，對重組質粒進行PCR驗證，均獲得了目的片段（圖7）。分別用Aat Ⅱ、EcoR Ⅰ雙酶切Ⅰ片段，用Spe Ⅰ、Sac Ⅰ雙酶切Ⅱ片段，對重組質粒進行酶切驗證，均得到了目的片段。將PCR、酶切鑒定正確的重組質粒進行測序，測序結果與目標序列相符，表明PpCYP51G1功能缺失載體構建成功，可用于下一步的轉化。

2.4 PpCYP51G1功能缺失轉化體的篩選和鑒定

隨機選取7株選擇性培養基上生長的抗性植株，分別提取其DNA及野生型植株DNA，以篩選出的抗性植株DNA、構建的功能缺失載體質粒、野生型植株DNA為模板，用hpt Ⅱ基因引物（hpt-F和hpt-R）進行PCR擴增。結果表明，獲得了PpCYP51G1功能缺失轉化體。

2.5 PpCYP51G1-GFP融合蛋白載體鑒定及亞細胞定位

用BamH Ⅰ對重組質粒進行酶切驗證（圖8），得到了目的片段。將酶切正確的重組質粒進行測序，測序結果與目標序列相符，表明PpCYP51G1-GFP融合蛋白載體構建成功。亞細胞定位結果表明，PpCYP51G1定位在內質網上。

3 討論

本試驗從小立碗蘚中克隆了CYP51基因PpCYP51G1的全長cDNA編碼序列，并對其氨基酸序列進行了分析，結果表明，CYP51G1在植物中具有較高的保守性，PpCYP51G1與擬南芥、水稻、衣藻、酵母CYP51G1的氨基酸序列一致性分別為65%、64%、50%、28%，與細胞色素P450家族其它成員的研究結果類似^[14]，因此，研究小立碗蘚細胞色素P450家族基因的功能對于揭示它們在其它植物中的功能具有借鑒意義。

PpCYP51G1跨膜區的預測結果表明，其N 端存在一個跨膜結構域，而GenBank中對小立碗蘚CYP51G1基因（GenBank登錄號為XM_001769361）的預測結果則顯示其編碼蛋白N端無跨膜區，原因是GenBank中預測的氨基酸序列不包括本試驗得到的PpCYP51G1蛋白N端的前22個氨基酸（MGDAEMQGAPVGESAVFDRSKV），而這段序列剛好是預測的N端跨膜區。我們認為PpCYP51G1的全長序列應該包括這個跨膜區，GenBank中小立碗蘚EST數據庫中的數據也證明這段序列是確實存在的。

此外，我們構建了PpCYP51G1基因的功能缺失載體及GFP融合蛋白載體，獲得了PpCYP51G1的功能缺失轉化體，并對該基因進行了亞細胞定位，為進一步研究其功能奠定了基礎。

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