流式細胞儀在植物科學領域中的應用及方法舉例

摘 要：流式細胞術是一種對處在液流中的細胞或其它生物微粒逐個進行多參數的快速定量分析和分選的技術。自發明以來，流式細胞儀已被廣泛應用在生物學和醫學的各個研究領域，極大地推動著生物學和醫學的發展和應用。該文闡述了流式細胞儀在植物科學領域應用，如細胞核分析、染色體分析、植物細胞和染色體分選、染色體文庫構建、逆境生物學及育種學等等，并對應用實例進一步進行了說明，為流式細胞儀在植物學領域的進一步應用推廣提供借鑒。

關鍵詞：流式細胞儀；植物科學；應用；方法

中圖分類號 Q94 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2013）11-19-03

流式細胞儀是一種對處在液流中的細胞或其它生物微粒逐個進行多參數的快速定量分析和分選的儀器。它集計算機技術、激光技術、流體力學、細胞化學、細胞免疫學為一體，按照細胞的物理或化學性質，進行細胞的分析和分選 [1-3]。自1974年BD（Becton，Dickinson and Company）公司研制出第一臺商用流式細胞儀（Fluorescence Activated Cell Sorting，FACSTM）以來，該技術方法又取得了巨大的進步，使得流式細胞儀在生物學，特別是醫學領域得到了廣泛的應用，被譽為“實驗室的CT”。

由于植物細胞自身的細胞粘連、具有細胞壁等特性，使得流式細胞儀在植物科學的應用稍稍滯后于血液學、免疫學等領域。目前，流式細胞儀在植物育種、生長發育、生理生態、系統進化、分類等領域，分子、細胞、整體乃至系統生物學水平等領域[1-6]都得到廣泛應用。

1 流式細胞儀原理

細胞制備成單細胞懸浮液并經特定的熒光染料染色后上機，細胞懸浮液在儀器壓力下形成流暢不間斷的細小液流，使這些單個細胞一個一個依次通過一個小室，進入小室的細胞被激光激活，在散射一部分激光的同時，細胞也發出熒光，這些散射的光信號和發射的熒光信號均被收集并進行分析[7]。熒光信號通過透鏡、光闌及濾片到達光電倍增管，儀器將檢測器測得的信號通過分析系統加以顯示記錄。流式細胞儀的測試結果是一個數據文件，它是由光信號強度經檢測器（硅光電二極管或光電倍增管）轉換成電信號輸出，又經多道脈沖分析器和模-數轉換，由微處理器編釋成一種數據文件，并經相連的電腦及配置的軟件系統將數據文件以圖形的方式顯示和數據統計分析（圖1）[7]。

圖1 流式細胞工作原理

2 流式細胞儀在植物科學領域的應用

2.1 植物細胞核分析 細胞核是細胞指令的發出場所和遺傳物質的儲存、加工及傳遞場所。流式細胞儀在細胞核分析方面涉及的應用范圍頗為廣泛，例如DNA、RNA、蛋白質含量的分析，染色質結構分析，細胞周期分析染色體倍性分析等方面[8-12]。

2.2 原生質體分析 正如前面所述，由于植物細胞結構的特殊性，流式細胞儀對植物細胞結構和功能的研究依賴于其原生質體的制備或細胞核的解離。通過對原生質體的分析研究植物細胞結構和功能等。通過流式細胞儀還可以研究原生質體產物分選，細胞融合產物分選，改良作物品種等方面[8-12]。

2.3 植物細胞染色體分析和染色體文庫構建 流式細胞儀利用熒光染色的方法能夠識別和分揀單個染色體。分揀的單一的染色體是構建染色體專性DNA文庫和基因定位的最好材料，因此流式分揀的染色體的一個主要用途是構建染色體專性文庫，這些染色體文庫可以廣泛應用在基因組分析和基因定位克隆中[8-12]。

2.4 植物細胞結構和功能研究 流式細胞儀已廣泛應用到植物細胞結構的研究中。例如細胞大小、細胞粒度、細胞表面面積、核漿比例、DNA含量與細胞周期、RNA含量、蛋白質含量、配體及特異抗原的研究中；流式細胞儀也被廣泛應用在諸如細胞特異性抗原（細胞表面/胞漿/核）、細胞內細胞因子、細胞活性、酶活性、激素結合位點、細胞受體信號轉導等功能性研究方面。這些應用為植物細胞生物學的研究提供了強大工具和理論基礎，并不斷豐富其發展[8-12]。

2.5 植物分類學和植物系統學（Plant systematic）研究 植物分類學和植物系統學是根據植物的特征，植物間的親緣關系、演化的順序，對植物進行分類的科學，并在研究的基礎之上建立和逐步完善植物各級類群的進化系統。流式細胞儀可在分子水平上對所研究物種待測的多個分子Marker如DNA、RNA序列等同時進行檢測，然后綜合定性、定量分析，從而對物種進行特征、歸類，并為其系統發育研究提供分子水平上的遺傳證據[8-12]。

2.6 逆境植物學和植物病理學（Plant pathology）研究 植物如何應對諸如干旱、低溫、高溫、鹽堿、病蟲害、環境污染等逆境脅迫是植物科學和農業科學共同關心的重大科學問題。逆境條件可以通過境信號在細胞中通過信號轉導和傳遞，最終誘導基因表達；逆境脅迫也可以通過代謝來調節基因表達，合成抗凍蛋白（Antifreeze proteins，AFPs）、熱激蛋白（Heat Shock Proteins，HSPs）、滲透調節蛋白（Osmotin）等抗逆蛋白質。然而植物抗逆的分子機制并不清楚。基于流式細胞儀在細胞信號傳導和蛋白功能研究等方面的強大功能，已被廣泛應用于植物抗逆研究和植物抗病研究中，流式細胞儀為抗逆因子和抗病因子的表達和活性檢測提供了很好的工具[8-12]。

2.7 植物育種研究 植物育種是植物科學和農業科學研究領域的另一重大科學問題，包括作物育種、園林植物育種等。1984年，LAAT和BLAAS制備了模式植物纖細單冠菊[Haplopappus gracilis（Nutt.）Gray]的完整染色體懸浮液，通過流式細胞術分離了2種染色體類型，開創了流式細胞遺傳學[13]。

流式細胞儀根據DNA含量的多少可以判斷染色體的數量，從而可以鑒定植物倍性，達到快速準確的效果，尤其適用作物育種群體檢測如多倍體育種。另一方面，通過對植物原生質體及染色體的分選使從分子水平上篩選特定優良基因，導入優良基因，改造物種成為了可能。流式細胞儀在植物育種中的應用，在提高作物抗逆能力和作物產量、培育園藝花卉等領域有著重要的研究意義。

3 流式細胞儀檢測方法應該舉例--細胞增殖能力

用流式細胞儀檢測細胞增殖能力的方法主要有以下兩種[13-17]：

3.1 相對計數法 細胞增殖最直接的結果就是細胞數目的增加，如果控制樣品的體積一定，細胞數目的增加就是細胞濃度的增加，那么在同一臺儀器上用相同的分析速度上樣計數時，濃度大的樣品單位時間內被檢測到的細胞數越多，上樣相同時間后得到的相對細胞數也就越多。同時也可以設置檢測相同數目的細胞個數后儀器自動停止并計時，通過分析各個檢測樣品的時間來比較細胞數目的相對多少，如果相同處理下樣品檢測時間短，則說明該樣品的細胞濃度高，即細胞數目多；反之，則說明樣品的細胞數量少。流式細胞術相對計數法測定細胞增殖的原理：將對照組和各實驗組控制在相同的條件下直接計數，然后比較計數結果得出增殖結論。

3.2 細胞周期法 在生物細胞中，DNA含量是比較恒定的參量，DNA含量隨著細胞增殖周期各時期不同而發生變化。（1）G0期細胞被認為是不參與增殖周期循環的一群細胞，即為靜止細胞，其細胞DNA含量為較恒定的2C；G1期細胞具有增殖活性，參與細胞周期循環，G1期細胞與G0期細胞DNA含量相同，均為二倍體DNA含量；當細胞進入S期后，DNA含量逐漸增加，從2C→4C值，一直到細胞DNA倍增結束，進入G2期，最終進入M期。在M期分裂為二個子細胞之前，G2和M期細胞的DNA含量均為恒定的4C值，即為四倍體細胞。（2）熒光染料和細胞DNA分子具有特異性結合，且有一定的量效關系，①DNA含量多少與熒光染料的結合成正比；②熒光強度與DNA分子結合熒光素多少成正比；③ 熒光脈沖與直方圖的通道值成正比。因此，FCM-DNA定量分析一個細胞增殖群時，可將二倍體DNA含量分布組方圖分為三部分，即G0/1、S、G2M。G0/1和G2M細胞峰的DNA分布均為正態分布，S期可以認為是一個加寬的正態分布。

流式細胞術可以檢測細胞內DNA的含量，所以可以檢測細胞周期，細胞周期各時期細胞比例：靜止期/DNA合成前期（G0/1期）、DNA合成期（S期）、DNA合成后期/有絲分裂期（G2M期）。

處于S期的細胞，DNA量處于二倍體和四倍體之間；處于G2/M期時，DNA量為四倍體。通過核酸染料標記DNA，并由流式細胞儀進行分析，可以得到細胞各個時期的分布狀態，計算出G0/G1%，S%及G2/M%，了解細胞的增殖能力，而細胞群體中處于S期和G2/M期的細胞比例越高，說明細胞增殖越活躍。在植物抗逆生理學研究中，通常以S期細胞比率作為判斷細胞增殖狀態的指標。正常細胞具有較恒定的DNA含量，而細胞病變過程中結構或染色體的異常是很常見的。這種變化在流式分析中以DNA倍體指數的形式表現出來，這一指數對于病變細胞的早期診斷，所以可以通過檢測細胞DNA的含量分析S期所占比例值，進而分析細胞增殖的強弱。

4 總結和展望

綜上所述，流式細胞儀在植物科學領域的研究中已經得到了廣泛的應用，幾乎涉及到各個方面，極大地推動著植物學科的發展，并在植物科學研究中扮演著重要的作用。

自從BD流式細胞儀發明以來，就不斷利用新的科學技術手段不斷革新，服務于生物學研究，本文通過對流式細胞儀在植物科學領域的應用及研究方法介紹，期望能取得更好的進展。

參考文獻

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（責編：張宏民）