磁性納米顆粒Fe3O4固定化纖維素酶的光譜學研究

摘 要：本文主要進行纖維素酶的固定化研究。使用氨水沉淀劑，磁性微粒Fe3O4采用共沉淀的方法制備，并作為載體對纖維素酶進行固定化，多次重復試驗以及傅里葉紅外驗證了纖維素酶在該載體上的固定，采用投射電鏡觀測了固定化酶顆粒的粒徑也外貌，還研究了酶的活性，固定化纖維素酶最佳的活性在pH值為3.94～5.50左右，制備的固定化纖維素酶具有較好的存儲性、熱穩定性以及PH值的寬泛性，本文為纖維素酶的開發和利用提供了一條新的研究途徑。

關鍵詞：磁性納米顆粒Fe3O4；固定化；纖維素酶；光譜學

前言

植物的主要組成部分之一就是纖維素，其含量約占植物干重的35%-50%，纖維素是世界上最廣泛分布的天然碳水化合物，據估計每年世界纖維素的產量達4×106萬噸。我國每年都會產生大量的植物，其蘊含的纖維素資源十分豐富，僅在農作物秸稈和植物皮核中蘊含的纖維素就有4億多噸，林業采伐與加工的剩余物中也蘊含有1000多萬噸的纖維素。有效的開發利用植物中的纖維素具有十分重要的意義，能夠有效的緩解能源危機、環境污染、節能減排及糧食短缺等問題。而目前對纖維素的利用總量還不到世界產量的0.5%，大量的纖維素資源還沒有得到有效、合理和廣泛的應用。目前對纖維素資源的開發利用已經成為世界上許多國家研究和開發的重點，而纖維素酶是纖維素開發利用的重要方向之一，已經成為纖維素開發利用的重要途徑之一。

目前，主要阻礙纖維素酶發展的障礙之一就是纖維素酶的酶解效率低下，纖維素是纖維素酶的底物，是不溶于水的，因此人們設計對纖維素的具有一定活性的來進行固化的酶的很困難的。而納米材料具有小尺寸效應、量子尺寸的效應、表面效應、宏觀量子隧道效應等特性，在許多領域都具有廣闊的應用前景，如光吸收、催化、醫藥、激光、新材料、磁介質等。伴隨著的納米技術的發展，光譜學正在成為研究納米材料的重要手段。本文的研究重點是利用氨水作為沉淀劑，采用共沉淀的方式來制備具有磁性的納米材料，以磁性的納米材料為載體，制備了固定化的纖維素酶，經過多次的重復性實驗以及傅里葉紅外的方法驗證了纖維素酶在磁性的納米材料上具有固定性，利用投射電鏡的方式表征了固定化的纖維素酶形貌，纖維素酶的活性則采用DNS分光光度法測量，并且進行了纖維素酶最佳催化的PH值以及溫度。研究結果表明該具有磁性的纖維素酶具有較好的存儲穩定性以及熱穩定性，提供了一條纖維素酶利用以及轉化的新途徑。

1 實驗

1.1 實驗儀器

分析純的化學試劑有：無水乙醇、氨水、醋酸、硫酸亞鐵、羧甲基纖維素鈉、三氯化鐵、醋酸鈉、磷酸二氫鈉、酸磷酸氫二鈉等，來源于國藥集團化學試劑有限公司。使用的纖維素酶是生物制劑，來源于立業生物公司。所用水均為去離子水。紅外光譜采用Nicolet儀器公司的傅里葉紅外光譜儀，透射電子顯微鏡為日本HITACHI公司，還使用到紫外-可見分光光度計（1cm石英比色皿）Cary250，來自Varian有限公司。

1.2 磁性材料制備

將摩爾比為1：2的FeSO4·7H2O和FeCl3·6H2O溶于蒸餾水，鐵離子濃度為0.3mol/l。放入燒瓶之中，持續通入氮氣，在快速攪拌的同時加入氨水，同時pH值保持在10左右。所得產物80℃下進行保溫30min，以達到產物陳化。再將所得物用蒸餾水多次清洗，除去雜質。將所得的磁性顆粒存放于pH為9左右的環境之中。

1.3 固定纖維素酶

將磁性的納米材料20～40mg，添加醋酸鹽緩沖液（pH4.55，含0.1mol/lNaCl）1ml以及CDI溶液（0.03g/ml緩沖液）0.5ml，進行超聲10min。再加入纖維素酶溶液（1.4～2.0mg/ml緩沖液）2.5ml，4℃進行超聲30min。在具有磁場的環境下放置1～2min，再將磁性微粒和溶液進行分離，再使用緩沖液多次清洗磁性微粒。

2 結果與分析

2.1 磁性納米材料的形貌表征

使用透射電鏡（TEM）觀測納米材料進行酶固定化前后的粒徑和外貌，固定的纖維素酶前后的TEM照片如圖1所示。

通過圖1可知采用共沉淀方法所得的磁性微粒粒徑20nm左右，微粒分布均勻。將纖維素酶進行固定后，微粒的外貌基本沒有改變，粒徑變化也不大，這就表明在纖維素酶的固定過程之中沒有破壞微粒的粒徑以及外貌，主要原因是酶只在微粒的表面進行固定。

2.2 紅外光譜研究磁性納米微粒

取少量纖維素酶、磁性微粒以及固定化的纖維素酶已經定量的KBr進行混合，磨碎壓片，使用傅里葉紅外儀進行測定其紅外光譜見圖2所示。

圖2傅里葉紅外光譜

從圖中可以看出（a）和（b）在580cm-1處出現特征峰，說明酶固定化后對磁性納米微粒本身沒有影響。（b）在1094cm-1處也出現特征峰，說明存在有組氨酸和鐵配位基，同時說明可以通過配位實現纖維素酶在磁性納米顆粒上的固定。此外，（a）在1625cm-1處有NH2吸收的特征峰，而（b）該特征峰變弱，所以Fe3O4上的氨基與CDI活化后的位于纖維素酶之上的羥基進行反應也可能對纖維素酶進行固定。

2.3 固定化酶影響因素

2.3.1 固定時間：使用試管四支，添加同質量的Fe3O4、纖維素酶、CDI以及緩沖液，進行超聲15、30、45和60min，再進行酶的活性測定，發現酶的活性沒有變化，表明15min已經將酶進行固定。

2.3.2 CDI用量：使用試管四支，添加同質量的Fe3O4以及緩沖液，改變CDI的濃度，0～4℃的溫度內進行超聲得到不同活性的酶，結果如表1所示，其中固定酶活以每克載體所具有的活力表示。

表1 CDI的濃度對固定酶活性的影響

由此可知，固定化酶的最佳活性在CDI濃度3.75mg/ml左右。

2.3.3 pH值的影響：保持其他條件相同的情況下改變緩沖液PH值，發現PH值在4.5-5.2時的效果最好。

3 結束語

以氨水作為沉淀劑，采用共沉淀的方式來制備具有磁性的納米材料，以磁性的納米材料為載體，制備的固定化的纖維素酶，具有較好的存儲性、熱穩定性以及PH值的寬泛性。此種方法為纖維素酶的開發和利用提供了新的研究思路，屬于纖維素酶未來研究和發展的重要方向之一。

參考文獻

[1]王玫，王芳，汪世龍，等.磁性納米顆粒Fe3O4固定化纖維素酶的光譜學研究[J].光譜學與光譜分析，2006，26（5）：895-898.

[2]陳洪章.纖維素生物技術[M].北京：化學工業出版社，2005.