一氧化氮供體SNP對水稻根中由硒引起的脂質過氧化的調節作用

摘要：研究以0.2和20 μmol/L Na2SeO3及一氧化氮供體硝普鈉（SNP）處理對水稻根中根系活力和硫代巴比妥酸反應產物含量，愈創木酚過氧化酶（GPX）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）以及抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性等生理生化指標的影響。結果表明，1 μmol/L SNP處理顯著提高0.2 μmol/L Na2SeO3處理下水稻根系活力，SNP通過促進CAT酶活性，緩解了膜脂過氧化；在20 μmol/L Na2SeO3處理下，1 μmol/L SNP明顯促進SOD酶活性，但顯著降低APX酶活性，顯著降低根系活力。NO對水稻根中Se引起的抗氧化活性變化具有調節作用，根系活力可以作為評價抗氧化活性的重要參考。

關鍵詞：水稻；硒；一氧化氮；抗氧化作用

中圖分類號：Q945 文獻標志碼：A 文章編號：0439-8114（2013）21-5133-04

Effects of Exogenous Nitric Oxide Donor SNP on Lipid Peroxidation Caused by Selenium in Roots of Rice Seedlings

XIAO Qiang

（Key Laboratory of Biological Resources Protection and Utilization of Hubei Province / Hubei Institutes for Nationalities， Enshi 445000， Hubei， China）

Abstract： In this study， we reported some antagonist effects of exogenous nitric oxide on oxidative stress of rice induced by selenium. The root activity， the contents of TBARS and the activities of GPX， SOD， CAT and APX in roots of rice seedlings treated with varied concentrations of selenium and 1 μmol/L SNP were investigated. The results showed that the root activity increased by treatment of SNP in 0.2 μmol/L Na2SeO3 group. SNP alleviated significantly the lipid peroxidation in rice seedlings via increasing CAT activities in rice root. In 20 μmol/L Na2SeO3 treated rice seedlings， SNP aggravated significantly the root activity loss via promoting SOD activities and repressing APX activity. Taken together， results suggested that NO regulates antioxidative activity caused by selenium in roots of rice seedlings. Root activity can be used as reference index of evaluating antioxidative activity.

Key words： rice； selenium； nitric oxide； antioxidation

一氧化氮（Nitric oxide，NO）是植物中一種重要的信號分子，在調節植物生長發育，促進植物細胞衰亡等方面發揮著重要作用[1]，進一步研究表明NO在植物中的某些功能與它對活性氧（Reactive oxygen species，ROS）代謝水平的調節密切相關，如NO可作用于煙草中含血紅素鐵的過氧化氫酶（Catalase，CAT）和含非血紅素鐵的抗壞血酸過氧化物酶（Ascorbate peroxidase，APX），參與對活性氧代謝的調節[2]。NO還可能通過提高超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）的活性和降低膜脂過氧化作用來減緩缺水造成的離體水稻葉片的衰老[3]。NO也可以通過促進鎘在根部積累并上調鐵吸收相關基因表達增強擬南芥對鎘毒的抗性[4]。我們的研究結果也表明0.01 mmol/L硝普鈉（Sodium nitroprusside，SNP）可顯著緩解鑭引起的氧化脅迫[5]。

硒（Se）是環境中一個十分重要的生命元素，它與硫元素在化學特性上有很多相似之處，硒在動物和人體內最主要的生物學功能是作為谷胱甘肽過氧化物酶系（GSH-Px）的組成成分，參與體內氧化還原反應，清除自由基，減少對生物膜等造成的機體過氧化損傷。在植物中，Se可以顯著增強小麥、玉米、大豆和油菜體內抗氧化能力，維持植株正常生長[6]。土壤環境因子、養分供應狀況等對植物Se吸收、轉運、富集以及代謝的影響已有較多報道。迄今，對于信號分子尤其是NO是否參與了Se誘導的抗氧化活性調節過程仍不為人知，我們在此報道外源SNP對由亞硒酸鈉（Na2SeO3）誘導的水稻根中抗氧化活性變化的調節作用。

1 材料與方法

1.1 材料培養與處理

水稻品種為金優58，種子經0.1% HgCl2消毒，水洗，25℃浸種、催芽。1周后用木村B溶液水培，溫度26 ℃，光照400 μmol/（m2·s），光/暗時間為12 h/12 h，至兩葉一心期在培養液中加入Se和SNP同時進行處理。Na2SeO3和SNP均購自上海生工生物工程有限公司（BBI原裝）。設3個Se處理，分別為0、0.2和20 μmol/L Na2SeO3；每種Se處理再設兩種SNP濃度，分別為0和1 μmol/L，共6個處理組。每個處理設3個重復，每天更換處理液1次，在處理3 d后測定表明各處理間根系活力差異顯著，因此取相應時段幼根進行相關生理生化指標測定。

1.2 測定項目與方法

1.2.1 根系活力 采用TTC法進行測定[7]。

1.2.2 硫代巴比妥酸反應產物（TBAPS）含量測定 取幼根0.7 g，加入4 mL 10% 三氯乙酸（TCA）研至勻漿，離心，取上清液，參照Dhindsa等[8]的方法測定。

1.2.3 酶液制備 取0.5 g新鮮水稻幼根于冰浴研缽中，加少許石英砂和1 mL預冷的酶提取液（用50 mmol/L、pH 7.8的磷酸緩沖液配制，內含1%聚乙烯吡咯烷酮，5 mmol/L的乙二胺四乙酸），測定APX時，提取液含5 mmol/L ASA，迅速勻漿，4 ℃，20 000 g離心20 min，取上清液備用。

1.2.4 蛋白質含量測定 采用Bradford法[9]測定，以牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA）作為蛋白質標準。

1.2.5 SOD活性測定 參照Beauchamp等[10]所建立的方法測定，SOD活性分析前過Sephadex G-25柱以避免SNP對活性測定的干擾，以抑制氮藍四唑（NBT）在光照下被還原50%的酶量為一個酶活性單位（U）。

1.2.6 GPX活性測定 參照Ruan等[11]的方法測定，以460 nm吸光值每分鐘上升0.1為一個酶活性單位（U）。

1.2.7 CAT活性測定 參照Chance等[12]的方法測定，以240 nm吸光值每分鐘減小0.1為一個酶活性單位（U）。

1.2.8 APX活性測定 參照Parida等[13]的方法測定，以280 nm吸光值每分鐘減小0.1為一個酶活性單位（U）。

1.3 數據分析

用SPSS軟件進行數據方差分析，以Origin軟件繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 根系活力的改變

由圖1可知，與對照組相比，0.2和20 μmol/L Na2SeO3處理對水稻根系活力沒有顯著影響；20 μmol/L Na2SeO3處理組顯著高于0.2 μmol/L Na2SeO3處理組；在無Se情況下，1 μmol/L SNP可以顯著提高水稻根系活力（P<0.05）。外加1 μmol/L SNP顯著提高0.2 μmol/L Na2SeO3處理下水稻根系活力；但在20 μmol/L Na2SeO3處理的水稻幼根中，外加1 μmol/L SNP則顯著降低根系活力。

2.2 TBARS含量的改變

如圖2所示，和根系活力相似，0.2和20 μmol/L Na2SeO3處理對水稻幼根TBARS含量沒有顯著影響；兩種濃度Na2SeO3處理之間差異不顯著。在無Se情況下，1 μmol/L SNP對TBARS含量亦無顯著影響。外加1 μmol/L SNP對0.2和20 μmol/L Na2SeO3處理組亦無顯著影響。

2.3 抗氧化酶活性的改變

作為植物抗氧化系統的一個重要組分，抗氧化酶在消除ROS方面具重要作用。SOD，GPX，CAT及APX的活性在各種脅迫下經常發生改變。與對照相比，0.2 μmol/L Na2SeO3處理對幼根中SOD的活性無顯著影響；20 μmol/L Na2SeO3處理則顯著下降（P<0.05）；單獨1 μmol/L SNP處理對幼根中SOD活性亦無顯著影響。外加1 μmol/L SNP可以顯著緩解20 μmol/L Na2SeO3處理引起的SOD活性下降（圖3A）。與SOD活性相比，不同處理條件下，GPX活性表現出不同的特征。各處理組間GPX活性差異不顯著（圖3B）。CAT活性變化如圖3C所示，與水稻幼根中SOD活性變化類似，0.2 μmol/L Na2SeO3處理對幼根中CAT的活性無顯著影響；20 μmol /L Na2SeO3處理則顯著下降（P<0.05）；單獨1 μmol/L SNP處理顯著提高幼根中CAT活性。外加1 μmol/L SNP顯著促進0.2 μmol/L Na2SeO3處理組活性（P<0.05），但對20 μmol/L Na2SeO3處理組CAT活性無顯著影響。如圖3D所示，與對照相比，0.2 μmol/L Na2SeO3處理顯著促進幼根中APX活性（P<0.05），20 μmol/L Na2SeO3處理引起幼根中APX活性顯著下降（P<0.05）；單獨SNP處理對幼根APX活性無顯著影響。外加1 μmol/L SNP對0.2 μmol/L Na2SeO3處理組幼根中APX活性亦無影響，但卻顯著降低20 μmol/L Na2SeO3處理組幼根中APX（P<0.05）。

3 討論

SNP普遍作為NO的外源供體，Delledonne等[14]發現0.5 mmol/L SNP大約釋放2.0 μmol/L NO。預備實驗以0、0.2、0.5、1、2、5、10、50 μmol/L SNP處理水稻根系，結果表明濃度達到1 μmol/L時，根系長度顯著高于對照組，而濃度超過5 μmol/L 時，根系生長與對照不存在差異，據此確定了本試驗SNP濃度；同時研究了0、0.2、2、10以及20 μmol/L Na2SeO3對葉綠素含量的影響，結果顯示在2 μmol/L以下差異不顯著，而10 μmol/L和20 μmol/L均顯著降低葉綠素含量，據此確定了本試驗硒濃度。

從本研究中可以看出，SNP和Se對根系活力存在協同效應：SNP協同低濃度Se可以提高根系活力，而SNP與高濃度Se共同處理則顯著降低根系活力。這與我們關于SNP和Se對水稻幼苗葉綠素含量的影響具有相似規律（見另文）。其可能原因在于：在厭氧情況下，植物根系線粒體是NO合成的重要場所[15]，NO通過降低低濃度Se引起的線粒體電子傳遞速率上升[16]而發揮抗氧化功能，維持了根系還原能力；另一方面，NO也加劇了高濃度硒引起的線粒體電子傳遞速率下降，進一步抑制了根系呼吸。

已有報道，低濃度硒可以顯著提高植物中抗氧化酶SOD和GPX轉錄水平，進而激活了植物抗氧化保護機制[17，18]。本研究與此不同，0.2 μmol/L Na2SeO3處理對SOD活性沒有影響，而20 μmol/L Na2SeO3處理則引起SOD活性顯著下降；GPX活性則不受Se處理濃度影響。這種差異可能源于所采用的不同植物材料和不同器官（根和葉片）。0.2 μmol/L Na2SeO3處理顯著提高了水稻根中APX酶活性，1 μmol/L SNP處理也可以提高水稻根中CAT酶活性，兩者都可以有效清除ROS，維持根系活力。Beligni等[19]認為，作為一種抗氧化劑，NO可以抵消許多由ROS介導的細胞毒害作用。在本研究中，總體來看，0.2 μmol/L Na2SeO3處理下，外加1 μmol/L SNP對于水稻幼根中CAT酶活性有顯著提高效應，與此同時，根系活力顯著升高；表明根系脫氫酶活性顯著升高。20 μmol/L Na2SeO3處理下，根中SOD活性顯著下降，與此同時CAT和APX活性也是下降的，有利于維持對ROS清除的相對平衡，因此，根系活力與對照相比差異不顯著。但在外加1 μmol/L SNP情況下，SOD活性上升到對照組水平，而APX酶活性水平進一步下降，由此導致ROS產生與清除不平衡，ROS累積加劇了對根系的損傷，引起根系活力顯著下降。上述研究結果與NO緩解高濃度稀土元素鑭引起的氧化性損傷以及鎘毒性的研究結果存在較大差異[5，20]。其可能原因在于鑭和鎘是植物非必需金屬元素，其毒性與金屬離子引起的過氧化有關[20]，NO可以直接拮抗其導致的過氧化效應；而Se屬于非金屬元素，主要通過類似植物必需元素硫方式參與細胞生化反應[21]；NO對其生理生化效應調節的詳細機制有待于進一步研究。

已有研究證實高等植物根部線粒體電子傳遞鏈是NO合成的主要場所[15]。在本研究中，1 μmol/L SNP促進了0.2 μmol/L Na2SeO3處理下水稻幼根中CAT酶活性，提高了根系活力；外加1 μmol/L SNP促進20 μmol/L Na2SeO3處理組水稻幼根SOD活性顯著上升，而APX酶活性水平進一步下降，由此導致ROS產生與清除失衡，引起根系活力顯著下降。上述主要研究結果表明NO對于水稻根中Se引起的脂質過氧化存在明顯調節作用，由于高等植物根部線粒體可以利用亞硝酸鹽合成NO[15]，通過合理施用氮肥以調節水稻根部內源NO合成，對于有效改善高硒地區水稻生長具有重要實踐意義。

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