大洪山地區蛹蟲草的分離馴化與鑒定

摘要：以大洪山地區野生蛹蟲草（Corddcps militaris Link.）為母本篩選優良菌種。結果表明，菌種D1、D3、D4平板培養性能較佳，菌絲致密健壯、氣生菌絲少、匍匐狀、轉色快，轉色深；菌種D1栽培產量最高達17.8 g/瓶，草體形態典型。菌種D1可作為大洪山本地優良菌種之一進行馴化。

關鍵詞：蛹蟲草（Corddcps militaris Link）；分離馴化；鑒定；大洪山

中圖分類號：S567.3 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）21-5248-03

Isolation， Domestication and Identification of Cordyceps Militaris Link. from Dahongshan Region

FANG Hua-zhou

（College of Biotechnology， Jingchu University of Technology， Jingmen 448000， Hubei， China）

Abstract： The experiment was carried out to screen excellent strains from wild Cordyceps militaris Link. in Dahongshan region. Results showed that the strain D1， D3 and D4 had good characteristics in the plate cultivation， compact and robust hyphae， procumbent， little aerial hyphae， color turned fast and dark. The yield of strain D1 was up to 17.8 g per bottle with typical grass performance and regarded as one of the excellent strains.

Key words： Cordyceps militaris Link.； sepration and domestication； identification； Dahongshan region

蛹蟲草（Corddcps militaris Link.）又名北冬蟲夏草、北蛹蟲草等，為冬蟲夏草近緣種，屬麥角菌科（Clavicipitaceae）蟲草屬（Corddceps Link）模式種，在我國分布廣泛[1，2]。研究證實，蛹蟲草營養豐富，具有與冬蟲夏草相同或相似的功能及活性成分，蟲草酸、蟲草素、蟲草多糖、超氧化物歧化酶（SOD）、腺苷等含量接近或高于天然冬蟲夏草，對消除疲勞、緩解緊張、提高人體免疫力、預防和治療慢性支氣管炎、肝炎、高血壓、心腦血管疾病、腎炎腎衰、性功能障礙等具有良好的功效，被譽為蟲草屬真菌后起之秀，是冬蟲夏草的理想替代品[1-5]。近年來，經我國科研人員多年努力，我國在世界上率先實現蛹蟲草人工種植，目前已基本實現工業化生產[4，5]。研究和開發本地蛹蟲草資源具有廣闊的經濟及市場前景。筆者在湖北省大洪山地區采集多株蛹蟲草標本，并進行了分離馴化及栽培試驗，現將有關情況報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

野生蛹蟲草采集于湖北省大洪山風景區寶峰山下一處緩坡密林中，寄主昆蟲及子實體基本完整，經鑒定為大洪山本地野生蛹蟲草菌株。

馬鈴薯（市場購買）、蛋白胨（北京奧博星生物技術公司）、葡萄糖（化學純，天津福晨化學試劑廠）、瓊脂（北京奧博星生物技術公司）、磷酸二氫鉀（化學純，天津凱通化學試劑公司）、硫酸鎂（化學純，天津凱通化學試劑公司）、維生素B1（藥店購買，湖北華中藥業公司）；250B型生化恒溫培養箱（廣東省醫療器械廠），LRH-250-GSII型微電腦人工氣候箱（廣東省醫療器械廠），FA2104型分析電子天平（上海良平儀器有限公司），SW-CJ-1F型超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司），30 W移動式紫外滅菌燈（武漢延安醫療器械廠），TP22型普通搖床（中國科學院武漢科學儀器廠），DX-400A型高壓蒸汽滅菌鍋（上海三申醫療器械有限公司）。

1.2 培養基

改良PDA固體培養基：馬鈴薯（去皮）200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨5 g，磷酸二氫鉀1 g，硫酸鎂0.8 g，瓊脂15 g，水1 000 mL，pH自然（實測值約6.5）；PDA液體培養基：可溶性淀粉30 g，葡萄糖10 g，蛋白胨10 g，磷酸二氫鉀2 g，硫酸鎂2 g，維生素B110 mg，水1 000 mL，pH 6.5；栽培岀草培養基：大米30 g，營養液45 mL。其中營養液配方：蠶蛹粉10 g，磷酸二氫鉀1 g，硫酸鎂0.8 g，維生素B110 mg，水1 000 mL，pH 7.5。各培養基[6-10]按常規方法配制，分別作為試管斜面、固體平板或液體培養基。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種分離 野生蛹蟲草流水洗去泥土，無菌水漂洗3～5次，取其子實體上半部分，以0.1%升汞溶液處理30 s、無菌水漂洗，以組織分離法切取1～2 mm大小組織塊，轉接至改良PDA試管斜面，適宜溫度培養，分離制備菌種[8，9]。

1.3.2 菌種性能與篩選 從各試管菌種挑取約1 mm大小菌種塊，分別接種至改良PDA平板培養基，適溫黑暗培養5 d后光照培養5 d，比較觀察各菌種菌株生長速度、菌絲形態、光照轉色能力、光照培養菌絲形態等，選取菌絲長勢好、健壯、轉色快、轉色深的菌株為初篩菌種。將初篩菌種轉擴為液體菌種，按常規方法進行栽培試驗，以實際栽培產量和草體形態為主要指標確定適宜菌種，并結合栽培過程全面檢驗和驗證菌種性能[10]。上述試驗各菌種菌株均5個以上重復，栽培出草20瓶重復。

2 結果與分析

2.1 菌種分離結果

共選取了6只野生蛹蟲草為母本，各寄主均為鱗翅目昆蟲幼體或蛹體，子實體形態較為典型，黃色至橘紅色，直徑3～4 mm、長3.5～5.0 cm，子實體經組織分離后制備菌種依次記為D1、D2、D3、D4、D5、D6；剔除遭感染試管，共成功分離37支菌種試管；其中D1試管9支、D2試管4支、D3試管6支、D4試管5支、D5試管6支、D6試管7支。

2.2 菌種培養性狀與初篩結果

將菌種轉接至平板培養基，模擬菌絲生長主要實際過程，觀察其生長及發育情況。閉光培養可反映菌絲營養生長情況；見光培養可反映菌絲轉色、出草等生殖生長情況[1，3]。試驗結果見表1。

從表1可以看出，各菌種生長均較為迅速，菌絲潔白、健壯、致密，氣生菌絲較少，轉色能力亦較強。分析其原因，各菌種均由原始母本直接組織分離制備，可良好遺傳母本菌絲生長、轉色乃至出草性能所致。菌絲生長快、健壯、氣生菌絲少、匍匐狀，則菌絲易于深入培養基內部，吃料迅速、營養充分，可為菌絲進入生殖生長奠定良好的營養及物質基礎；轉色快、轉色深、顏色典型是菌絲良好的生長發育及進入生殖生長、具有良好生長性能的重要標志，是菌絲扭結出草的重要和關鍵步驟[1，3，10]。菌絲生長快、健壯致密、氣生菌絲少、轉色能力強，是優良蛹蟲草菌種菌絲必須具備的重要基本性能[11，12]。進一步比較各菌種生長及發育狀況，菌種D1生長速度最快，達4.38 mm/d，與其他菌種生長速度差異顯著（P<0.05）；閉光培養菌絲潔白健壯、致密、長勢好，氣生菌絲少，匍匐狀，見光培養菌絲致密、轉色快、顏色深、橘黃色，表明其培養性能最優；菌種D3、D4次之，菌絲長勢較好、生長較快、氣生菌絲較少、轉色較深，本試驗將D1、D3、D4作為初選菌種。試驗中還觀察到各菌種試管斜面菌絲均表現致密健壯潔白匍匐狀，生長性狀差異不顯著，可能與試管斜面面積較小有關。

2.3 栽培試驗與復篩結果

栽培試驗是檢驗菌種性能的根本方法，是鑒定和篩選菌種是否具有優良生產性狀的主要依據[10]。將菌種D1、D3、D4轉擴為液體菌種，按常規方法進行栽培試驗，試驗結果見圖1及表2。

從圖1可以看出，D1子座較多、生長趨勢好，草體形態最典型；D3次之，子座略呈彎曲狀、少數有分叉；D4子座過多、分叉、叢枝狀，生長趨勢弱，形態最差。對照表2可以看出，菌種D1生長迅速、轉色快，產量最高，平均鮮重達17.8 g/瓶，已接近一般蛹蟲草種植水平，說明菌種D1具有良好的生產性能。對栽培過程中菌絲生長情況進行分析，菌種D1菌絲萌發快、料面氣生菌絲少、吃料迅速，菌絲滿瓶時間短，菌絲致密、轉色快、轉色深，完成轉色后約7～8 d子座即開始萌出，均快于其他試驗組；對照表1及原始母本情況，D1母本形態典型、生命力旺盛、子實體較長且粗壯，平板培養健壯致密、生長迅速、氣生菌絲少、轉色快、轉色深，說明菌種D1已遺傳和保持母本優良性能，可作為實際生產用種。試驗中，菌種D3滿瓶時間較長、料面氣生菌絲較少、轉色較快、產量較高，菌種D4滿瓶時間較短、料面氣生菌絲較多、轉色時間較長、較淡、萌出芽體較多、草體短小、分叉、產量低。從生長過程分析，氣生菌絲少，菌絲迅速深入培養基內部，吸收營養充分，因而轉色快，產量高，顯然與菌種之間的性能差異有關。

3 小結

菌種性能在蛹蟲草栽培過程中起著決定性作用。目前，組織分離法和子囊孢子分離法是蛹蟲草菌種分離與制備的兩種常用方法。子囊孢子分離法因存在減數分裂及配對過程，變異較大，多用于優良菌種選育及菌種復壯；組織分離法為無性繁殖方式，多用于優良母本菌種的分離繁殖。本試驗以子實體組織分離法從本地多株野生蛹蟲草中篩選出菌種D1，人工栽培性能良好，其草體形態和產量具有較高商品價值，具有良好的應用前景。鑒于我國地域多樣性，需在此基礎上進一步開展其功能活性成分及深加工研究，以促進本地蟲草資源良性發展。

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