一例轉基因克隆水牛主要臟器組織結構觀察

摘要：應用石蠟切片及HE染色技術觀察轉基因克隆水牛牛犢的心臟、肝、腎、胰腺、睪丸等主要臟器組織結構，并使用激光共聚焦顯微鏡對其心臟、肝、腎、睪丸冰凍組織切片進行熒光觀察。結果表明，轉基因克隆水牛心臟結構異常，心肌纖維間隙過大，閏盤結構不明顯，出現炎癥、出血等病理現象；肝、腎、胰腺、睪丸結構完整，細胞形態、分布均正常。激光共聚焦顯微鏡下各冰凍組織切片中均可見較均勻綠色熒光，初步證實綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）基因成功整合到了水牛體內。

關鍵詞：水牛；轉基因克隆；臟器；組織結構

中圖分類號：S814.8 文獻標識碼： A 文章編號：0439-8114（2013）21-5251-02

Observation of Main Visceral Organ Structure in one Transgenic Cloned Buffalo

LU Jun-qiu，HU Wei-kun，ZHOU Yue，WANG Xiao-li

（College of Animal Science and Technology， Guangxi University， Nanning 530005， China）

Abstract： The main visceral organs such as heart，

轉基因動物克隆技術是20世紀中后期興起的一項技術。近年來，隨著轉基因動物研究的發展和深入，該技術被廣泛應用于生物學、免疫學、生物制藥及畜牧育種等領域[1，2]。

2010年初，廣西大學動物科學技術學院的科研人員將一只3月齡的水牛胎兒的成纖維細胞經體外傳代培養后，把含標記基因[綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）]和篩選基因的轉基因載體導入，構建得到轉基因克隆重構胚，并于2010年2月5日植入一頭2歲半的母牛子宮內。同年12月19日順利產下一對雄性雙胞胎。其中一頭體重為20.5 kg，正常存活；另一頭體重為14 kg，夭折，無法憑外部觀察判斷死因。對夭折牛犢用紫外燈照射，可見頭部和四肢明顯表達綠色熒光蛋白基因[3]。

本試驗試圖通過組織冰凍切片和熒光顯微觀察技術查證外源基因是否成功轉入水牛的內部組織器官；并通過石蠟切片和HE染色技術對轉基因克隆水牛主要臟器組織結構進行觀察分析，為探查犢牛死亡原因提供理論依據，也為今后轉基因克隆水牛的研究提供必要的理論基礎。

1 材料與方法

心臟、肝、腎、胰腺、睪丸組織取材于廣西大學動物科學技術學院的轉基因克隆水牛。所取以上部分器官組織用75%的乙醇固定，經脫水、透明、石蠟包埋后切片（厚度約7 μm），HE染色[4，5]，顯微鏡下觀察、攝片。其余心臟、肝、腎、睪丸組織于包埋劑中在冷凍臺上迅速冷凍固定，切片（厚度5～10 μm），激光共聚焦顯微鏡下進行觀察、攝片[6]。

2 結果與分析

2.1 轉基因克隆水牛組織HE染色切片觀察

在4×10倍光鏡下，對轉基因克隆水牛心肌膜組織切片觀察，可見心肌膜內的心肌纖維間隔多且寬；心肌纖維間隔中分布大量結締組織（圖1）。10×10倍光鏡下，可見心臟橫紋肌不明顯，閏盤結構不明顯，心肌纖維間可見破裂的血管，在其周圍分布大量細胞群（圖2）。40×10倍光鏡下，可見心肌間有大量血細胞、巨噬細胞及少量淋巴細胞（圖3）。轉基因克隆水牛肝、腎、胰腺、睪丸的HE染色組織切片分別在4×10倍、10×10倍、40×10倍光鏡下觀察，組織結構清晰完整，細胞形態分布正常，沒有病理異常現象。

2.2 轉基因克隆水牛組織冰凍切片觀察

在激光共聚焦顯微鏡下，用波長為488 nm的光波透射過冰凍切片，可觀察到心臟、肝、腎、睪丸組織冰凍切片均呈現一片較為均勻的綠色熒光（圖4）。

3 小結與討論

在轉基因動物工程中，常用綠色熒光蛋白基因與外源DNA相融合，再將外源基因導入動物體，從而便于對基因轉入結果進行檢測。若轉入動物體內各組織器官產生綠色熒光，且熒光顏色均勻，說明外源基因整合成功；若轉入動物體內只有少部分組織器官或某個部位產生綠色熒光，說明外源基因整合不理想或不成功[7]。本試驗中在激光共聚焦顯微鏡下，轉基因克隆水牛的心臟、肝、腎、睪丸組織冰凍切片均呈現出一片綠色熒光，因此可初步判斷GFP基因已成功整合進該頭水牛的內部組織中。

正常繁殖方式出生牛的心肌膜內的心肌纖維成螺旋狀排列，多集合成束，心肌纖維之間較緊密并有閏盤特殊連接[8]。轉基因克隆水牛的心肌纖維出現肌纖維間隙過大、閏盤結構不明顯等異變，表明該水牛心臟結構異常；心肌膜還出現出血和發炎癥狀，這些癥狀都影響了心臟的收縮力度，導致心功能降低。同時，對該轉基因克隆水牛的肝、腎、胰腺、睪丸組織HE染色切片觀察表明，其結構形態均和正常繁殖方式出生的水牛類似，功能正常。因此，可初步判斷該轉基因克隆牛犢夭折可能是由于心臟功能下降引起的。

參考文獻：

[1] 崔文濤.轉基因牛研究進展[J].中國畜牧獸醫，2007，34（7）：47-50.

[2] 張 賀，王承利.轉基因動物研究進展[J]. 動物醫學進展，2008（7）：59-62.

[3] 陸月玲.世界首例轉基因克隆水牛在邕問世[N].南國今報，2010-12-20.

[4] 芮菊生.組織切片技術[M]. 北京：人民教育出版社，1980.

[5] 王 平.組織學實驗指導[M].北京：北京大學出版社，1981.

[6] 孟運蓮，付承英.組織學與胚胎學實驗指導（雙語）[M].武漢：湖北科學技術出版社，2006.

[7] 王燕容，何仲義.形態學實用技術[M]. 上海：第二軍醫大學出版社，2010.

[8] 沈霞芬.家畜組織學與胚胎學[M]. 北京：中國農業出版社，2000.