山羊SKIP基因重組腺病毒載體的構(gòu)建

摘要：試驗(yàn)利用Gateway技術(shù)構(gòu)建含山羊SKIP基因的重組腺病毒載體。首先采用PCR擴(kuò)增山羊SKIP基因連接入pcDNA3.1（+），將酶切回收的SKIP產(chǎn)物片段克隆至腺病毒穿梭載體pYr-adshuttle-2 獲得重組質(zhì)粒pYr-adshuttle-2-SKIP。從該重組質(zhì)粒上，利用LR同源重組將SKIP-EGPF表達(dá)框轉(zhuǎn)移至腺病毒骨架質(zhì)粒pAd/PL-DEST，獲得重組腺病毒質(zhì)粒pAd-SKIP。該質(zhì)粒經(jīng)pacI 線性化后轉(zhuǎn)染HEK293A細(xì)胞包裝病毒，獲得重組腺病毒rAd-SKIP。重組腺病毒分別經(jīng)酶切和PCR 等方法進(jìn)行鑒定。熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效果。結(jié)果證實(shí)腺病毒載體中含有SKIP基因的目的片段，熒光顯微鏡發(fā)現(xiàn)該重組腺病毒能在C2C12細(xì)胞中高效表達(dá)。表明成功構(gòu)建了同時(shí)表達(dá)SKIP蛋白和綠色熒光蛋白的重組腺病毒，為下一步開展關(guān)于SKIP基因的功能研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：重組腺病毒；山羊SKIP基因；基因過表達(dá)；感染細(xì)胞

中圖分類號(hào)：Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）21-5258-04

Construction of A Recombinant Adenovirus Vector pAd-SKIP

XIONG Qi，ZHANG Nian，SUO Xiao-jun，LI Xiao-feng，LIU Yang，CHEN Ming-xin

（Hubei Key Laboratory of Animal Embryo Engineering and Molecular Breeding / Institute of Animal Husbandry and Veterinary， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan 430064，China）

Abstract： In this study， the Gateway technology was used to construct a recombinant adenovirus vector pAd-SKIP. The SKIP gene was amplified first by PCR and inserted into pcDNA3.1（+） vector， then cloned into adenovirus adshuttle vector pYr-adshuttle-2 to obtain recombinant plasmid pYradshuttle-2-SKIP. The expression cassette of SKIP-EGPF was transferred to pAd/PL-DEST with LR recombinant reaction to acquire recombinant adenovirus plasmid pAd-SKIP-EGFP. The correct clone was linearized and tranformed into 293A cells. Recombinant adenovirus pAd-SKIP was obtained and identified. The transfection efficiency was observed under the fluorescent microscope. The results confirmed that the recombinant adenovirus vector contained goat SKIP gene. This vector was found to infect C2C12 cells efficiently. It indicated that the recombinant adenovirus expressing SKIP gene and green fluorescence was successfully constructed， laying the foundation for further study.

Key words： recombinant adenovirus vector； goat SKIP gene； gene overexpression； infected cells

5′肌醇磷酸酶（SKIP）由Ijuin等[1]首先發(fā)現(xiàn)并分離，在動(dòng)物各組織中廣泛表達(dá)，尤其在心臟骨骼肌和腎臟中高表達(dá)，因此SKIP被稱為骨骼肌和腎臟富含的5′肌醇磷酸酶。SKIP被鑒定為通過水解PI（3，4，5）P3為PI（3，4）P2而調(diào)控胰島素信號(hào)的5′-脂質(zhì)磷酸酶。PI（3，4，5）P3的下游PI（3，4，5）P3/Akt信號(hào)在成肌分化進(jìn)程中有重要作用[2-4]。SKIP雜合突變小鼠比目魚肌和股四頭肌的質(zhì)量顯著提高[5]也提示SKIP具有調(diào)節(jié)骨骼肌纖維發(fā)育的功能。因此有必要進(jìn)一步研究該基因在體內(nèi)外參與骨骼肌生長發(fā)育的調(diào)控機(jī)制。本試驗(yàn)采用基因工程技術(shù)，成功構(gòu)建了SKIP基因重組腺病毒，為下一步在體內(nèi)外研究SKIP對(duì)成肌分化的作用機(jī)制以及SKIP基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+）和腺病毒穿梭載體pYr-adshuttle-2購自長沙贏潤生物技術(shù)有限公司；腺病毒骨架載體pAd/PL-DEST、LR重組酶、DMEM培養(yǎng)液及新生牛血清購自Invitrogen公司。限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶購自TaKaRa公司；CloneEZ試劑盒購自Genescript公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、dNTPs、Taq酶及DNA Maker購自天根生化科技（北京）有限公司；酵母粉和胰蛋白胨購自O(shè)xide公司；腺病毒包裝細(xì)胞HEK293購自美國ATCC；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 PCR引物的設(shè)計(jì)、合成及PCR擴(kuò)增 應(yīng)用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物，在上、下游引物5′端分別引入用于定向克隆的限制性酶切位點(diǎn)KpnⅠ、XhoⅠ，同時(shí)在上游引物中添加kozak序列GCCACC，用以增強(qiáng)基因表達(dá)。提取山羊體細(xì)胞RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA為模板擴(kuò)增目的基因，引物序列如下：SKIP-F：5'GGTACCGCCACCATGGAGGCCATGAG3′；SKIP

-R：5'CTCGAGTCAGATCTGTGGCTGGGCTTCAT3′。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性40 s， 75 ℃退火40 s，72 ℃延伸90 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。然后將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)是否出現(xiàn)預(yù)期中的SKIP基因帶。

1.2.2 pcDNA3.1（+）-SKIP質(zhì)粒的構(gòu)建 將pcDNA3.1（+）和兩端帶酶切位點(diǎn)的SKIP基因分別以KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分離酶切片段，分別回收的線性化pcDNA3.1（+）質(zhì)粒和SKIP cDNA片段以定向克隆的方式用T4 DNA連接酶連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑選菌落擴(kuò)增，小量提取質(zhì)粒后以KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切，若電泳后得到1.3 kb和5.4 kb兩個(gè)片段，則證明SKIP cDNA已插入到真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+）上。

1.2.3 SKIP基因克隆至腺病毒穿梭載體pYr-adshuttle-2 用KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切穿梭載體pYr-adshuttle-2和重組表達(dá)載體pcDNA3.1（+）-SKIP，凝膠電泳回收線性化的pYr-adshuttle-2和SKIP基因，用T4 DNA連接酶連接過夜，反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。次日挑取卡那霉素選擇性培養(yǎng)基篩選的陽性克隆子進(jìn)行菌落PCR鑒定；提取質(zhì)粒進(jìn)行KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定；同時(shí)送陽性菌落到北京奧科生物公司測(cè)序。

1.2.4 采用LR體外同源重組將SKIP表達(dá)框克隆至腺病毒表達(dá)載體pAd/PL-DEST 在10 μL LR體外同源重組反應(yīng)體系（含pYr-adshuttle-2-SKIP、pAd/PL-DEST和LR Clonase Ⅱ）中，加入蛋白酶K消化LR Clonase Ⅱ。將充分反應(yīng)后得到的反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布于含AmpR抗性（終濃度為100 μg/mL）的LB平板上，37 ℃恒溫箱培養(yǎng)過夜。接著再次從每個(gè)培養(yǎng)皿上隨機(jī)挑取若干個(gè)單克隆菌落接種于50 mL含AmpR抗性（終濃度為100 μg/mL）的LB培養(yǎng)液中，37 ℃恒溫?fù)u床（250 r/min）培養(yǎng)過夜。用中量提取試劑盒提取質(zhì)粒，對(duì)提取的質(zhì)粒進(jìn)行PCR驗(yàn)證XbaⅠ酶切鑒定。

1.2.5 重組腺病毒pAd-SKIP的包裝 HEK293A細(xì)胞的準(zhǔn)備：提前12～24 h將1 mL HEK293A細(xì)胞懸液（1.5×106 個(gè)細(xì)胞/mL）接種在培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)染前1 h換成無血清的DMEM培養(yǎng)基250 μL。

轉(zhuǎn)染HEK293 A細(xì)胞包裝病毒：用脂質(zhì)體2000介導(dǎo)，由PacⅠ線性化的腺病毒DNA轉(zhuǎn)染HEK293 A細(xì)胞。當(dāng)有明顯的細(xì)胞病態(tài)反應(yīng)（CPE）現(xiàn)象，且有>50%脫壁時(shí)即收細(xì)胞，加入500 μL無菌PBS緩沖液重懸，干冰浴和37 ℃間快速反復(fù)凍融3次裂解細(xì)胞，室溫下1 000 r/min離心15 min，沉淀細(xì)胞碎屑。將上清液再次感染HEK 293 A細(xì)胞擴(kuò)增病毒，直至細(xì)胞在1周內(nèi)有明顯的CPE現(xiàn)象，且有>50%脫壁時(shí)即收細(xì)胞。同樣用無菌PBS緩沖液重懸，干冰浴和37℃間快速反復(fù)凍融3次裂解細(xì)胞，室溫下1 000 r/min 離心15 min，收集上清液，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，-80 ℃保存。并進(jìn)行PCR鑒定。

1.2.6 測(cè)定重組腺病毒滴度 取純化后的病毒液100 μL，10%SDS 20 μL、PBS 880 μL，65 ℃熱浴30 min后，渦旋3次，離心后測(cè)定病毒基因組DNA的OD260 nm和OD280 nm，據(jù)此計(jì)算病毒的顆粒數(shù)和純度，1 OD260 nm =1012 PFU/mL，若OD260 nm /OD280nm >1.3，表明純度較高。病毒滴度（PFU/mL）=OD260 nm×稀釋度×1012。

1.2.7 病毒感染C2C12細(xì)胞 將C2C12細(xì)胞（1×106個(gè)細(xì)胞/mL）接種于12孔板，每孔1 mL，12 h后將培養(yǎng)液吸出，各孔分別加入MOI 50～150的Ad-SKIP，常規(guī)培養(yǎng)48 h后，在倒置熒光顯微鏡下分別用可見光和熒光觀察、成像。

2 結(jié)果與分析

2.1 pcDNA3.1（+）-SKIP的酶切鑒定結(jié)果

用KpnⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定，PCR擴(kuò)增SKIP基因的正反向引物分別帶有KpnⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)。將含有插入方向正確的SKIP cDNA的重組pcDNA3.1（+）-SKIP經(jīng)KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切產(chǎn)生大小分別為1.3 kb和5.4 kb的片段（圖1）。

2.2 pYr-adshuttle-2-SKIP的重組鑒定結(jié)果

將SKIP基因連接入pYr-adshuttle-2載體，陽性克隆經(jīng)KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，pYr-adshuttle-2載體大小為4 470 bp，SKIP基因大小約為1 350 bp，由酶切結(jié)果（圖2）可知，該克隆為正確克隆。將酶切鑒定正確的pYr-adshuttle-2-SKIP送去測(cè)序。并將測(cè)序結(jié)果與欲得到的目的序列相比對(duì)，顯示獲得的SKIP基因片段序列完全正確，證實(shí)pYr-adshuttle-2-SKIP構(gòu)建成功。

2.3 重組腺病毒載體pAd-SKIP的鑒定

將SKIP基因表達(dá)框采用LR體外重組技術(shù)克隆至表達(dá)載體pAd/PL-DEST，陽性克隆經(jīng)XbaⅠ單酶切鑒定，可切出一條約550 bp和一條約2.3 kb的條帶，且大帶大于8 kb（實(shí)際有3條大帶，即18 kb、8 kb、8 kb，但是一般很難分開，所以看上去就是一條粗帶）。由圖3結(jié)果可以初步判斷pAd-SKIP構(gòu)建成功。接著以質(zhì)粒pAd-SKIP為模板，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增SKIP片段，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖4。由圖4可見，PCR擴(kuò)增出的片段大小與SKIP基因片段大小一致，證實(shí)pAd-SKIP載體構(gòu)建成功。

2.4 重組腺病毒rAd-SKIP的產(chǎn)生和PCR鑒定

將PacⅠ線性化的腺病毒DNA轉(zhuǎn)染HEK293A，當(dāng)細(xì)胞有明顯的CPE現(xiàn)象，且有>50%脫壁時(shí)即收細(xì)胞進(jìn)行裂解收病毒。提取腺病毒基因組DNA，以之為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。引物用載體上自帶的CMV和BGH引物驗(yàn)證。由PCR鑒定結(jié)果（圖4）可知，用載體上自帶的引物擴(kuò)增出與SKIP基因長度同樣大小的片段，表明此腺病毒中有SKIP基因，而且相關(guān)表達(dá)框都在。證實(shí)rAd-SKIP包裝成功。

2.5 重組腺病毒對(duì)成肌細(xì)胞C2C12的感染

用不同MOI的重組腺病毒感染C2C12細(xì)胞，當(dāng)MOI為150時(shí)，超過80%的細(xì)胞出現(xiàn)熒光（圖5），表明所構(gòu)建的重組腺病毒生物活性高，可以有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)目的基因表達(dá)。

3 小結(jié)與討論

SKIP是調(diào)節(jié)PI3K-Akt信號(hào)通路的關(guān)鍵5′肌醇磷酸酶。在肌源細(xì)胞中，血清饑餓可誘導(dǎo)IGF2自分泌。IGF2與IGF1受體互作，激活PI3K，產(chǎn)生PI-3，4，5-P3，PI-3，4，5-P3募集到細(xì)胞膜上激活A(yù)kt（蛋白激酶B），接著激活成肌基因的轉(zhuǎn)錄[5]。因此PI3K-Akt信號(hào)與成肌分化緊密相關(guān)。近年來，一些新的信號(hào)通路、分泌因子和信號(hào)分子不斷被發(fā)現(xiàn)能調(diào)控PI3K-Akt信號(hào)。如肌醇磷酸酶SKIP，它通過水解PI3K合成的脂質(zhì)第二信使PI-3，4，5-P3，參與Akt（蛋白激酶B）的激活[6-8]。但SKIP是否調(diào)控PI3K-Akt信號(hào)介導(dǎo)的成肌分化仍有待研究。

基因的過表達(dá)是研究基因功能的重要手段之一，將外源基因有效地導(dǎo)入靶細(xì)胞表達(dá)是后續(xù)研究的先決條件。腺病毒（Adenovirus）是目前最高效可靠的重組病毒表達(dá)系統(tǒng)之一，可用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中瞬時(shí)及高水平地表達(dá)目的蛋白。具備宿主范圍廣，不依賴細(xì)胞周期，病毒滴度高，有較好的生物安全性等優(yōu)點(diǎn)[9]。腺病毒表達(dá)系統(tǒng)中的難點(diǎn)主要在于如何將外源基因表達(dá)框或者外源的shRNA表達(dá)框構(gòu)建至腺病毒骨架載體上。由于腺病毒骨架載體比較大（～30 kb），而且載體中的一些常用酶切位點(diǎn)幾乎都有多個(gè)，如果用常規(guī)的酶切-連接的方式將外源基因或者shRNA表達(dá)框構(gòu)建至腺病毒骨架載體上，則成功率很低，因此，目前的腺病毒表達(dá)系統(tǒng)基本上都是用同源重組的方法將外源基因構(gòu)建至腺病毒骨架載體上。

本試驗(yàn)采用了Invitrogen公司的BLOCK-iT腺病毒表達(dá)系統(tǒng)和Gateway 技術(shù)，與市面上其他腺病毒表達(dá)系統(tǒng)往往利用大腸桿菌或者293細(xì)胞自身的同源重組系統(tǒng)不同，即利用LR 重組酶進(jìn)行體外重組。與當(dāng)前其他腺病毒表達(dá)系統(tǒng)相比，這種體外重組更加方便、快速，重組效率更高。在本研究中，構(gòu)建了含山羊SKIP基因的腺病毒載體，并且經(jīng)酶切鑒定分析和PCR結(jié)果證實(shí)SKIP重組病毒構(gòu)建成功。病毒滴度高，并且可以高效感染C2C12細(xì)胞，表達(dá)能有效介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染，為下一步證實(shí)SKIP對(duì)骨骼肌細(xì)胞成肌分化的調(diào)控等研究奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] IJUIN T， MOCHIZUKI Y， FUKAMI K， et al. Identification and characterization of a novel inositol polyphosphate 5-phosphatase[J]. Journal of Biological Chemistry，2000，275（15）：10870-10875.

[2] TURECKOVA J， WILSON E， CAPPALONGA J， et al. Insulin-like growth factor-mediated muscle differentiation collaboration between phosphatidylinositol 3-kinase-Akt-signaling pathways and myogenin[J]. Journal of Biological Chemistry，2001，276（42）：39264-39270.

[3] GONZALEZ I， TRIPATHI G，CARTER E， et al. Akt2， a novel functional link between p38 mitogen-activated protein kinase and phosphatidylinositol 3-kinase pathways in myogenesis[J]. Molecular and Cellular Biology，2004，24（9）： 3607-3622.

[4] CENNI V， SIRRI A， RICCIO M， et al. Targeting of the Akt/PKB kinase to the actin skeleton[J]. Cell Mol Life Sci，2003， 60（12）： 2710-2720.

[5] ERBAY E， PARK I-H， NUZZI P D， et al. IGF-II transcription in skeletal myogenesis is controlled by mTOR and nutrients[J]. The Journal of Cell Biology，2003，163（5）：931-936.

[6] IJUIN T， TAKENAWA T. Regulation of insulin signalling and glucose transporter 4（GLUT4） exocytosis by the phosphatidylinositol 3，4，5-trisphosphate （PIP3） phosphatase， SKIP[J]. J Biol Chem，2012，287（10）：6991-6999.

[7] MANNING B D， CANTLEY L C. AKT/PKB signaling： navigating downstream[J]. Cell， 2007，129（7）：1261-1274.

[8] KANG H Y， SHIM D， KANG S S， et al. Protein kinase B inhibits endostatin-induced apoptosis in HUVECs[J]. J Biochem Mol Biol，2006，39（1）：97-104.

[9] 童 強(qiáng)，吳清明，黃永章，等.p27kip1復(fù)制缺陷腺病毒重組體的構(gòu)建與鑒定[J].武漢大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2002，23（1）：9-12.