固定化技術在殼聚糖酶生產中的應用

摘要：以產酶活性與產酶穩定性為指標評價3種固定化細胞產殼聚糖酶（Chitosanase， EC3.2.1.99）方法，以酶比活力、酶結合效率、酶活力回收率及穩定性評價4種固定化殼聚糖酶方法，以篩選最優固定化方案應用于殼聚糖酶的生產。結果表明，海藻酸鈉殼聚糖包埋法固定化細胞的產殼聚糖酶活性較高且穩定性好；海藻酸鈉殼聚糖吸附包埋固定化殼聚糖酶的酶比活力、酶結合效率與酶活力回收率均為最高，且穩定性強。

關鍵詞：固定化技術；殼聚糖；殼聚糖酶（Chitosanase， EC3.2.1.99）；海藻酸鈉

中圖分類號：Q556+.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）21-5282-03

Application of Immobilization Technique in Producing Chitosanase

YUAN Jian-ping，HOU Xiao-qiang

（College of Life Science， Langfang Normal University， Langfang 065000，Hebei， China）

Abstract： Chitosanase production was optimized through evaluating three methods of cells immobilization using the activity and stability of enzyme production as indicators. Four methods of enzyme immobilization were evaluated using of the enzyme combination efficiency， enzyme activity recovery and enzyme stability as indicators. The results showed that the sodium alginate and chitosan embed method was the optimal method of cells and enzyme immobilization due to its best performance in the activity and stability of enzyme production and in the enzyme activity， enzyme combination efficiency， enzyme activity recovery and enzyme stability.

Key words： immobilization technique； chitosan； chitosanase（EC3.2.1.99）； sodium alginate

殼聚糖酶（Chitosanase，EC3.2.1.99）是一種高效、專一水解殼聚糖制備殼寡糖的酶[1，2]。近年來，利用專一性殼聚糖酶水解殼聚糖制取殼寡糖已成為甲殼素工業的研究熱點與前沿[3，4]。目前殼聚糖酶研究多集中于菌種篩選與游離細胞產酶條件等方面。固定化細胞與固定化酶技術對于提高酶的生產與應用效率有重要意義[5，6]。本試驗采用多種方法對產殼聚糖酶菌種及殼聚糖酶固定化進行研究，旨在篩選最適固定化細胞及固定化酶的方法。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

殼聚糖 （脫乙酰度≥80%，濟南海得貝海洋生物工程公司），海藻酸鈉（黏度范圍：1.05～1.15，天津市永大化學試劑開發中心），乙酸、NaOH、甲醇、戊二醛、HCl、NaCl、CaCl2等試劑均為國產分析純。

1.2 菌種與培養基

產殼聚糖酶菌株Yg，廊坊師范學院生命科學學院微生物實驗室保存提供。改良PDA培養基：馬鈴薯（去皮）200 g，葡萄糖30 g，蛋白胨2 g，KH2PO4 0.5 g，（NH4）2SO4 0.5 g，維生素B1 10 mg，蒸餾水1 000 mL，115 ℃高壓滅菌30 min[7]。產酶培養基：KCl 5 g，NaCl 5 g，MgSO4·7H2O 5 g，K2HPO4 0.75 g，FeSO4 0.01 g， 蛋白胨8.5 g， 牛肉膏0.25 g，殼聚糖 10 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.5～8.0，121 ℃高壓滅菌30 min[8]。

1.3 方法

1.3.1 固定化細胞產殼聚糖酶 將Yg菌株于改良PDA斜面上活化2次，而后接種于改良PDA液體培養基，36 ℃、180 r/min培養16 h，再用0.75%無菌生理鹽水5 000 r/min離心洗滌2次，每次20 min，取菌體沉淀4 ℃保藏備用。采用3種方法對細胞進行固定化處理：①海藻酸鈉包埋法。取2.5%海藻酸鈉溶液50 mL，加入2 g濕菌體，攪拌混勻，用8號針頭從離液面10 cm高處將其滴入2% CaCl2溶液中，濾出凝膠小球，重新置于2% CaCl2溶液中，4 ℃靜置硬化2 h[9]。②海藻酸鈉殼聚糖包埋法。2.5%海藻酸鈉溶液中加入1%的殼聚糖，配制海藻酸鈉殼聚糖膠體溶液。取該溶液50 mL，加入2 g濕菌體，攪拌混勻，用8號針頭從離液面10 cm高處將其滴入2% CaCl2溶液中，濾出凝膠小球，重新置于2% CaCl2溶液中，4 ℃靜置硬化2 h[10]。③殼聚糖吸附法。將2.5%殼聚糖膠體溶液用8號針頭滴入凝結液（20%甲醇和30%NaOH）中，作用2 h后得到中空殼聚糖球，取出用去離子水洗滌，而后放入Yg菌懸液中，吸附2 h，取出殼聚糖球并用0.75%無菌生理鹽水洗滌后備用[11]。

將各試驗組固定化菌體小球放入改良PDA液體培養基中，36 ℃、120 r/min 預培養12 h，而后放入產酶培養基中，30 ℃、120 r/min 培養24 h。過濾取濾液于5 ℃、5 000 r/min離心15 min，取上清液即為粗酶液并測定其酶比活力。將產酶后的小球過濾回收，去離子水洗滌后再次產酶，觀察固定化細胞的重復利用性能[12，13]。

1.3.2 殼聚糖酶的固定化 取上試驗中所得殼聚糖酶粗酶液，利用4種方法分別對其進行固定化處理：①殼聚糖吸附法。3%的殼聚糖膠體溶液，用8號針頭將其滴入凝結液（20%甲醇和30%NaOH）中，作用2 h后得中空殼聚糖球，取出后用去離子水洗滌3次，吸水紙吸干。加入殼聚糖酶液至剛好沒過球，吸附3 h，取出后去離子水洗滌，收集剩余酶液及洗液并測定其體積，稱量殼聚糖球質量[14]。②殼聚糖交聯后吸附法。按①法制備殼聚糖球，而后將其加入1%戊二醛溶液中，室溫交聯6 h，去離子水洗滌、吸干。殼聚糖酶吸附方法同①[14]。③酶先交聯后殼聚糖吸附法。按①法制備殼聚糖球，取5 mL殼聚糖酶液與0.1 mL 1%戊二醛溶液混勻，作用1 h后加入殼聚糖球，溶液沒過球即可，3 h后取出，用去離子水洗滌，收集剩余酶液及洗液并測定其體積，稱量該殼聚糖球質量[15]。④海藻酸鈉殼聚糖吸附包埋法。取含5%海藻酸鈉、2%殼聚糖的海藻酸鈉-殼聚糖膠體溶液5 mL與等量的殼聚糖酶液混勻，用8號針頭從離液面10 cm處將其滴加到2%CaCl2溶液中。濾出凝膠小球，重新置于2% CaCl2溶液中4 ℃靜置硬化2 h，濾出凝膠小球用去離子水洗滌，收集前后CaCl2溶液及洗液并測定其體積，稱量該凝膠小球質量[14]。

測定各試驗組固定化殼聚糖酶的酶比活力，計算酶結合效率及酶活力回收率。過濾回收初次反應后固定化酶小球，去離子水洗滌后重復反應，觀察固定化殼聚糖酶回收及重復利用效率。

1.4 酶活力測定及計算方法

殼聚糖酶活力測定：將酶液與3%殼聚糖溶液分別預熱至45 ℃，取5 mL酶液加入50 mL 3%殼聚糖溶液中，混勻并于45 ℃、180 r/min條件下作用，定時取出反應液，加1 mol/L NaOH溶液調pH至8.0，沸水浴15 min終止反應，離心取沉淀于105 ℃烘干至恒重，稱量并計算酶活。酶活力單位定義：每1 min降解1 μg不溶性的殼聚糖為可溶性殼聚糖所需的酶量定義為一個酶活力單位[8]。

洗液中殼聚糖酶活力測定方法同上；固定化殼聚糖酶活力測定時，以固定化殼聚糖酶取代酶液，其余方法同上。

殼聚糖酶液酶比活力=每毫升殼聚糖酶液中所含有的酶活力單位數（U/mL）

固定化殼聚糖酶酶比活力=每克干燥的固定化殼聚糖酶中所含有的酶活力單位數（U/g）[16]

酶結合效率=（原酶液總活力-未固定酶活力）/原酶液總活力×100%[16]。其中原酶液總活力為用于固定化的粗酶液中殼聚糖酶的活力總和，未固定酶活力為固定化處理后剩余酶液及洗液中殼聚糖酶活力總和。

酶活力回收率=固定化酶活力/原酶液總活力×100%[16]。其中固定化酶活力為固定化處理后所得固定化殼聚糖酶的活力總和。

2 結果與分析

2.1 不同方法固定化細胞產酶活力及回收利用性能比較

3種方法固定化細胞產酶活力及回收利用性能測定結果見表1。由表1可見，殼聚糖吸附法固定化細胞第一次產酶活力最強， 但是2次產酶活力差異極大，且固定化小球的機械強度差，穩定性也不高，很難再重復利用。海藻酸鈉殼聚糖包埋法固定化細胞第一次產酶活力略低于殼聚糖吸附法，2次產酶活性穩定，且固定化小球機械強度很高，菌體泄露少，重復性好。綜合比較，選擇海藻酸鈉殼聚糖包埋法為最優固定化細胞方案。

2.2 不同方法固定化殼聚糖酶性能比較

各種方法所得固定化酶的性能結果見表2。由表2可知，海藻酸鈉殼聚糖吸附包埋法所得固定化殼聚糖酶酶比活力、酶結合效率與酶活力回收率均為最高，且重復利用過程中酶活力損失少，固定化酶的機械強度高，穩定性強，為最佳固定方法。

3 小結與討論

殼聚糖是產殼聚糖酶的誘導物，在固定化細胞過程中加入殼聚糖可明顯提高產酶性能，但是單純應用殼聚糖進行固定化的機械強度差；固定化殼聚糖酶的過程中，殼聚糖吸附法對酶活力影響小，但酶的結合效率較低且重復性差，戊二醛交聯則明顯影響了殼聚糖酶的活性。綜合分析認為，海藻酸鈉殼聚糖包埋法為最優固定化細胞產殼聚糖酶方案。海藻酸鈉殼聚糖吸附包埋法為固定化殼聚糖酶的最佳方法。

參考文獻：

[1] 戴 蕓，朱旭芬.微生物殼聚糖酶的研究概況[J].浙江大學學報，2004，30（20）：229-236.

[2] 周念波，李軼群，涂紹勇.殼聚糖酶的分離純化及性質研究[J].食品科技，2008，4（2）：4-7.

[3] 袁建平，李國輝，王淑敏，等.聚合度4～6殼寡糖的制備及其活性研究[J].食品科技，2012（8）：248-250.

[4] 徐 瑞，郭占云，戚正武.殼聚糖酶的純化、基因克隆及其酶學特性的鑒定[J].藥物生物技術，2008，15（2）：94-99.

[5] 喬德亮，胡 冰，曾曉雄.酶固定化及其在食品工業中應用新進展[J].食品工業科技，2007，7（6）：304-308.

[6] 張 茜，劉 濤，侯紅萍.提高固定化酶活力方法的研究進展[J].釀酒，2008，35（2）：15-18.

[7] 邱樂泉，楊 琳.假單胞菌H3殼聚糖酶的固定化研究[J].浙江工業大學學報，2007，35（2）：185-189.

[8] 袁建平，李 潔，王利敏.高產殼聚糖酶菌株選育[J].廊坊師范學院學報，2009，9（1）：66-67.

[9] 李 峰，呂錫武，嚴 偉.聚乙烯醇作為固定化細胞包埋劑的研究[J].中國給水排水，2000，16（12）：14-17.

[10] 袁建平，李紅艷.固定化細胞產殼聚糖酶條件的研究[J].廊坊師范學院學報，2010，10（6）：64-65.

[11] 袁定重、張秋禹，侯振宇，等.固定化酶載體材料的最新研究進展[J].材料導報，2006，20（1）：69-72.

[12] 朱俊晨，葉心華，林 胄，等.產糖化酶黑曲霉的固定化研究[J].微生物學雜志，2001，21（3）：38-40.

[13] 周 桂，何子平，禤金彩.雙載體法固定化黑曲霉發酵產殼聚糖酶的研究[J].西南大學學報（自然科學版），2007，29（5）：104-107.

[14] 夏文水，譚 麗.殼聚糖固定化酶研究進展[J].食品與科技，2007，23（6）：300-305.

[15] 王 俊.以殼聚糖為載體固定化海藻糖合成酶[J].化工進展，2004，23（10）：1117-1120.

[16] 肖玉良，鄭連英，游桂榮，等.固定化殼聚糖酶的動力學性能研究[J].泰山醫學院學報，2007，28（1）：1-3.