阿侖膦酸鈉對人骨髓間充質干細胞體外骨向誘導的研究

【摘要】 目的：探討不同濃度阿侖膦酸鈉對人骨髓間充質干細胞體外骨向誘導增殖和成骨誘導分化能力的影響。方法：取生長狀態良好的第四代細胞，分為實驗組（不同濃度的阿侖膦酸鈉，A-F組）、空白對照組（L-DMEM，G組）和陽性對照組（地塞米松，H組）各自誘導成骨分化。觀察細胞形態，放射免疫法檢測各組hBMSCs骨鈣素的分泌能力，實時熒光定量PCR檢測各組細胞培養液中Runx2和Osx mRNA的表達情況，并檢測經成脂肪細胞誘導分化后細胞內脂蛋白脂酶（LPL）mRNA的表達情況。結果：hBMSCs誘導分化至第7天時，A-F組大部分細胞仍呈長梭形，G組部分細胞開始出現形態學改變；各組細胞培養基中骨鈣素均隨誘導分化時間推移而增多；各組細胞表達Osx和Runx2 mRNA也隨誘導分化時間推移而增多；hBMSCs經誘導分化21 d時，A-F組細胞Osx和Runx2 mRNA表達量進一步增加，E組和F組超過半數細胞陽性表達，高于其他阿倫磷酸鈉工作液誘導組；在陰性對照組，始終未見有細胞形態學改變、骨鈣素表達和Osx和Runx2 mRNA表達。結論：ALN能促進hBMSCs增殖和骨向分化，1×10-6mol/L為其誘導分化的合適濃度。

【關鍵詞】 阿侖膦酸鈉； 人骨髓間充質干細胞； 體外誘導； 骨向分化

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2013.14.075

阿侖膦酸鈉可以抑制各種情況下的骨量丟失，包括原發性骨質疏松和肢體制動、雙側卵巢切除術后等各種原因造成的繼發性骨質疏松[1-2]，同時可以提高骨生物力學水平。研究發現在組織水平， 阿侖膦酸鈉能夠降低骨轉換，形成鈣正平衡，使骨量增加，但其分子機制目前還不十分清楚，一般認為其作用的靶細胞為成熟的破骨細胞[3]，也有人認為阿侖膦酸鈉在一定濃度下可影響成骨細胞的增殖，甚至可能促進成骨細胞成熟分化[4-5]，另外不排除在誘導骨髓基質干細胞向成骨細胞分化方面起作用。目前，阿倫磷酸鈉對成骨細胞的增殖有不同的研究結果，多數學者認為適宜濃度下阿倫磷酸鈉促進成骨細胞的增殖，甚至可能促進成骨細胞增殖或成熟分。但其濃度相關性影響細胞增殖的機制有待進一步研究。筆者就不同濃度的阿侖膦酸鈉對人骨髓間充質干細胞體外骨向誘導進行實驗，發現了體外培養所需的最適濃度，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、儀器和人骨髓間充質干細胞 所需試劑：L-DMEM（DMEM-低糖培養基， Gibco公司，美國）、胎牛血清（fetal bovin serum，FBS，杭州四季青）、0.25%胰酶/EDTA（杭州）、人淋巴細胞分離液（密度1.077 g/ml，天津市TBD生物中心）、磷酸鹽緩沖鹽水（PBS，武漢博士德）、青霉素/鏈霉素雙抗（杭州）、CD31、CD45、CD29、CD44小鼠抗人流式抗體（abcam）、FITC標記大鼠抗小鼠二抗（武漢博士德）、IBMX（3-異丁基-1-甲基黃嘌呤）、胰島素和吲哚美辛均購自Sigma公司；油紅O購自Amresco公司；離心管、培養皿和96孔培養板（Corning， 美國）、倒置相差顯微鏡（德國Leica公司）、C02培養箱（美國Thermo Formo公司）、離心機（Beckman Coulter）、Beckman Coulter流式細胞儀器、超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）、恒溫水箱和氣浴恒溫振蕩器（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限）。

本實驗所有標本均取自因骨性關節炎需行全髖關節置換或膝關節表面置換術的患者。同時本研究需排除患有其他骨關節疾病包括類風濕性關節炎、強直性脊柱炎、系統性紅斑狼瘡、骨腫瘤、甲狀腺和甲狀旁腺疾病以及腎功能不全的患者。

1.2 誘導分化步驟 取融合至80%～90%第4代人骨髓間充質干細胞，進行分孔成骨誘導分化。每個96孔板分為8個組（A-H組，每組12孔），每個孔加入不同濃度的阿倫磷酸鈉工作液（購于石家莊制藥集團有限公司），濃度分別為1×10-10、1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5 mol/L（分別為A-F組），同時設立空白對照組和陽性對照組，分別加入等體積不含阿倫磷酸鈉工作液的L-DMEM作為陰性對照組（G組），和加入含濃度為1×10-8 mol/L的地塞米松誘導液作為陽性對照組（H組）。將3個96孔板置于37 ℃、5%CO2的孵育箱內培養。3個96孔板細胞分別進行成骨誘導時間為7、14和21 d，誘導分化期間每2天換液1次。

1.3 人骨髓間充質干細胞體外誘導向成骨分化的鑒定 人骨髓間充質干細胞體外誘導向成骨分化第7、14和21天時，分別進行放射免疫法對細胞培養液中骨鈣素分泌能力進行檢測和采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測誘導分化后的人骨髓間充質干細胞Runx2和Osx mRNA的表達情況，同時采用qRT-PCR檢測經成脂肪細胞誘導分化后細胞內脂蛋白脂酶（LPL）mRNA的表達情況。

1.4 人骨髓間充質干細胞體外誘導向成骨分化細胞形態變化 人骨髓間充質干細胞進行誘導成骨分化后，每2天顯微鏡下觀察一次細胞形態改變情況，同時觀察細胞生長、成骨分化情況。

1.5 放射免疫法檢測細胞培養基中骨鈣素含量 骨鈣素放射免疫試劑盒購于中國原子能科學研究院。放射免疫儀型號為：Fj-2008全自動免疫計數儀（西安262廠生產）。放射免疫法的具體步驟參照試劑盒說明書。將成骨誘導分化7、14和21 d后的細胞培養基進行收集，分析培養基中骨鈣素的含量。

1.6 qRT-PCR檢測誘導分化細胞的LPL、Runx2、Osx、β-actin表達 通過以下五步驟進行操作：（1）引物設計合成；（2）細胞總RNA的提取；（3）逆轉錄反應；（4）熒光定量PCR反應；（5） LPL、Osx和Runx2 mRNA表達量分析。

1.7 統計學處理 采用 SPSS 13.0軟件進行統計分析，計量資料以（x±s）表示，采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞誘導成骨分化形態改變 到第7天時，A-F組阿倫膦酸鈉工作液誘導組大部分細胞仍呈長梭形，只有小部分細胞見形態發生變化，空白對照細胞形態無明顯變化（圖1）。誘導分化至第14天時，阿倫膦酸鈉工作液組更多細胞形態出現改變，與誘導分化至第7天時比較，較多細胞由長梭形開始向圓形轉變，但細胞數量仍較少，各組細胞形態都在不同程度改變，在E組和F組，細胞形態改變較明顯。空白對照細胞仍無明顯變化。在地塞米松誘導分化組，細胞大多呈圓形并可見反光（圖2）。細胞誘導分化至第21天時，A-F組細胞誘導分化改變有所提高，尤其在E組和F組，與A-D組相比，較多細胞向成骨分化，在顯微鏡下觀察可見較多細胞有反光。在地塞米松誘導分化組細胞呈圓形，顯微鏡下觀察大部分細胞可見反光（圖3）。

圖1 第7天各組細胞形態

注：A-F組大部分細胞仍呈長梭形，G組細胞形態無明顯變化

圖2 第14天各組細胞形態

注：A-F組更多細胞形態出現改變

圖3 第21天各組細胞形態

注：A-F組細胞誘導分化改變有所提高

2.2 放射免疫法檢測細胞培養基中骨鈣素含量 細胞誘導分化至第7、14和21天時，A-F組培養基中骨鈣素含量見表1，而骨鈣素含量有隨細胞成骨誘導分化而增加趨勢。

表1 各組培養基中骨鈣素含量 ng/ml

組別誘導分化時間

第7天第14天第21天

A組

B組

C組

D組

E組

F組

H組0.03±0.01*△#

0.03±0.02*△#

0.05±0.02*△#

0.05±0.02*△#

0.06±0.01*

0.08±0.02*

0.14±0.060.17±0.04*△#

0.19±0.05*△#

0.20±0.04*△#

0.21±0.05*△#

0.27±0.09*

0.28±0.08*

0.46±0.130.24±0.06*△#

0.25±0.05*△#

0.26±0.05*△#

0.27±0.06*△#

0.46±0.07*

0.52±0.06*

0.82±0.09

注：G組為空白對照組未能檢出骨鈣素，故表中未列G組；*與同一時間點H組比較，P<0.05；△與同一時間點E組比較，P<0.05；#與同一時間點F組比較，P<0.05

2.3 qRT-PCR檢測誘導分化細胞LPL、Runx2、Osx的表達見表2。

3 討論

目前關于阿侖膦酸鈉在誘導BMSCs成骨分化的確切作用機制仍不清楚。文獻報道阿侖膦酸鈉對破骨細胞的作用可能通過以下作用機制：（1）阿侖膦酸鈉可有力吸附在骨的表面，阻止膦酸鹽晶體的生長和溶解，同時改變了骨基質蛋白的特性，防止破骨細胞進行黏附。（2）阿侖膦酸鈉與骨結合后，一旦被破骨細胞酸化誘導，便在吸收位點局部釋放出來，干擾破骨細胞膜的完整性，使破骨細胞對一些小離子的通透性增加。同時在骨表面維持足夠的濃度梯度抑制破骨細胞活化的過程并抑制其泌酸過程。（3）阿侖膦酸鈉也可能作用于成骨細胞或BMSCs，間接抑制成熟破骨細胞的功能或抑制破骨細胞前提的增殖或分化，甚至有些學者認為阿侖膦酸鈉并非直接作用于破骨細胞[6]，而是通過成骨細胞介導抑制破骨細胞活性，從而抑制骨吸收。Fabian等[7]經過體外實驗證明阿侖膦酸鈉有促進BMSCs增殖和向成骨細胞分化的作用。蔣四清等[8]證明1×10-8 mol/L的阿侖膦酸鈉對成骨細胞有較強的增殖作用。成骨細胞的來源之一就是由BMSCs分化而來，而目前關于阿侖膦酸鈉對BMSCs成骨誘導分化的研究較少。

本研究發現，阿侖膦酸鈉誘導分化BMSCs到第7天時，較少細胞向成骨分化，主要表現在細胞形態改變不明顯，培養基中骨鈣素表達量低，同時qRT-PCR檢測成骨相關標志物Osx和Runx2 mRNA在不同濃度組間表達量均較低且組間無明顯差別，而在地塞米松誘導分化組，一部分BMSCs已開始向成骨分化。誘導分化至第14天時，阿侖膦酸鈉誘導組的細胞成骨分化較第7天時有所提高，尤其在E和F兩個劑量較高組，細胞形態向成骨轉化增加，同時培養基中骨鈣素以及細胞中Osx和Runx2的mRNA表達量也相應升高，與A-D較低濃度組相比，差異具有統計學意義，說明較高濃度阿侖膦酸鈉組在誘導BMSCs向成骨分化至第14天時，已開始進入迅速誘導分化期。誘導分化至第21天時，在E和F組大多數細胞經細胞形態學、骨鈣素表達量和qRT-PCR證實向成骨轉化，在A-D組誘導分化也有所提高，提高相對較小。而在陰性對照組始終未見細胞改變。本研究證明1×10-6和1×10-5 mol/L濃度的阿侖膦酸鈉誘導液誘導BMSCs成骨分化至14 d時，已開始進入迅速分化期，誘導至21 d時成骨分化明顯比其他低濃度組好，而在E和F兩組間誘導分化差別不大，故筆者認為1×10-6 mol/L濃度的阿侖膦酸鈉誘導液具有較好的誘導效率，雖然本研究只誘導分化了21 d，但已有半數以上的細胞向成骨分化，故推測隨著時間的延長將可能有更多細胞向成骨分化。

本研究初步證明，低濃度的阿侖膦酸鈉具有較好的誘導效應，在臨床工作中，長期使用低濃度阿侖膦酸鈉將可以使從骨髓動員的BMSCs成骨分化率增加。筆者認為1×10-6 mol/L濃度的阿侖膦酸鈉誘導BMSCs成骨分化至21 d已可以取得較好的效果，從而可為下一步研究阿侖膦酸鈉誘導BMSCs成骨分化的分子生物學機制提供基礎。

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（收稿日期：2012-12-12） （本文編輯：陳丹云）