食品中金黃色葡萄球菌PCR檢測方法的建立

[摘 要] 目的：建立快速檢測食品中金黃色葡萄球菌的PCR方法。方法：優化金黃色葡萄球菌DNA提取方法并設計基因特異性引物，采用PCR方法擴增金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶（nuc）編碼基因，驗證檢測的特異性及靈敏度。結論：所檢出的金黃色葡萄球菌在497bp處出現特異片段，該方法具有較高的敏感性和特異性，可作為食品中金黃色葡萄球菌快速檢測的手段。

[關鍵詞] 金黃色葡萄球菌 PCR DNA提取

[中圖分類號] TS201.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1003-1650 （2013）05-0057-01

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureu.SA）可分泌多種毒性蛋白質。其分泌的葡萄球菌腸毒素（Staphylococcal eaterotoxi，SE），可引起金黃色葡萄球菌食物中毒[1]。因此，如何應用快速準確的檢測方法，對于診斷金黃色葡萄球菌引起的食物中毒及預防該菌引起食物中毒有重要意義[2-4]。現階段對金黃色葡萄球菌的檢測，以往主要依賴常規微生物學方法，一般需要5～7 天，既費時又費力，為此，本研究利PCR技術擴增SA基因來快速直接檢測金黃色葡萄球菌，取得了很好的效果，現將試驗結果報告如下。

一、材料與方法

1.材料

1.1 試驗菌種

金黃色葡萄球菌標準菌株、大腸桿菌，李斯特菌、枯草芽孢桿菌，由本實驗室保存。

1.2 主要試劑

蛋白酶K，購自上海Sangon公司，TaqDNA聚合酶，10×buffer，25mmol/L MgCl2，dNTP，DNA Marker，均購自華美生物工程公司。

1.3 引物合成

上游引物F：5’-CAAGTCTAAGTAGCTCAGCAAAT-3’；下游引物R：5’-CCATCAGCATAAATATACGCTAAGC-3’。引物擴增核苷酸長度為494 bp。引物由上海生物工程有限公司合成。

1.4 儀器與設備

GL-16G 型高速臺式離心機，（上海醫用分析儀器廠），TGRADIENT 型 PCR 擴增儀，（BIOMETRA，德國），DYY-III 型電泳儀，（北京六一儀器廠），Jel Doc2001 型凝膠成像系統（BIO-RAD，美國）。

1.5檢測樣品

從吉林市周邊奶牛場隨機采集生鮮奶樣，共10 份。

2.方法

2.1黃色葡萄球菌基因組DNA 的提取[5，6] 取300μl菌懸液，離心，收集菌體，加入TE緩沖液467μl，20 mg/ml溶菌酶12μl，0℃ 1 h，并間隔搖晃幾次，取出放置-20℃，20min，立即放入69℃水浴10 min，加入10%SDS 53μl，69℃水浴15 min，取出加入5 mol/L NaC1 87μl，CTAB/NaC1（1%CTAB，0.73mol/L NaC1）68-69℃水浴15min，-20℃置30min，取出加入等體積的氯仿/苯酚（200μl：200μl）混勻，離心取上清；重復上述步驟一次，加入等體積的氯仿/苯酚（200μl：200μl）混勻，離心取上清；最后用2倍體積的冰的無水乙醇混勻，-20℃靜置30min，離心去上清，沉淀用70%的乙醇洗滌，干燥30min，沉淀溶于40μl TE中，于-20℃保存。

2.2 PCR 擴增 反應體積為40μl。其中10×PCR buffer 5μl， dNTP（ 濃度為2.5 mmol/L） 2.5μl， 引物F和引物R（ 濃度為5μmo1/L） 各2.5μl， 模板溶液1μl， 雙蒸水16μl， 置98℃水浴10 min， 再冰浴5min， 加Taq 酶（3U/μl）0.5μl， 最后加10μl石蠟油覆蓋。PCR 循環參數： 95℃預變性10 min； 94℃變性40s， 54℃退火45s， 72℃延伸90s，循環30次，4℃保存。

二、結果

1.PCR擴增引物基因的特異性

金黃色葡萄球菌為陽性菌，擴增出長為497bp的DNA片段，然而李斯特菌、枯草芽孢桿菌、等都未擴增出片段，結果為陰性。

2.PCR擴增nuc基因的敏感性

將食品中金黃色葡萄球菌DNA樣品（105ng/μl進行10倍梯度稀釋為10.5ng/μl、1.05ng/μl、105pg/μl、10.5pg/μl、1.05pg/μl、分別取1μl上述樣品進行PCR擴增，該體系在樣本稀釋至10.5pg/μl時候，仍可以擴增出特異條帶，表明該方法具有較高的靈敏度。

三、討論

綜上所述， 本研究所建立的PCR方法檢測金黃色葡萄球菌具有特異性強、敏感性高、檢測成本低、檢驗周期短、操作簡便等優點。對多種食品樣品檢測的結果表明， 該法對檢測食品中金黃色葡萄球菌的污染具有較好的應用價值， 為檢測食品中的金黃色葡萄球感染的臨床診斷和流行病學調查提供了較好的手段， 在應對細菌性食物中毒突發公共衛生事件中具有重要的意義。

參考文獻

[1]黃嶺芳 賴衛華 張莉莉（南京大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌330044）2009年6月第25卷第6期（食品中金黃色葡萄球菌快速檢測方法的研究進展）.

[2] 黃佩瑁，石超，潘世揚，等.金黃色葡萄球菌DNA提取方法的改良[J].臨床檢驗雜志，2002，20（2）：106.

[3] [美]J.薩姆布魯克，D.w.拉塞爾，著.黃培堂，譯.分子克隆 實驗指南[M].第3版.北京：科學出版社，2002.

[4] 唐俊妮.金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶相關基因的功能與特征分析.華中農業大學，2007.

[5]王曉梅，馬莉，陳穎，等1感染性腹瀉病原菌分布分析[J]1醫學論壇雜志， 2006， 27（13）：43- 451 .

[6]Jun Ni Tang ，Fei Long ，Xian Ming Shi ，Chinese Journal of Health Laboratory Technology，Aug 2008；Vol 18 No 8.

[7] 陳靖，陳葉.用酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測金黃色葡萄球菌腸毒素[J].中國食用菌，1999，18（5）：39-40.