甲型H1N1病毒HA、NA氨基酸序列比較及抗原性表位預測

【摘要】 目的：比較新型甲型H1N1流感病毒分離株HA、NA氨基酸序列之間的差異，分析HA、NA蛋白可能的抗原性細胞表位。方法：從GenBank中選取28株世界各地的新型甲型H1N1流感病毒分離株并下載各株HA、NA的氨基酸序列；使用Clustal X和MEGA 2.0軟件對氨基酸序列的進行進化樹分析；用Protean軟件預測HA、NA蛋白的B細胞表位；用NetMHCⅡ 2.2預測T細胞抗原表位。結果：世界范圍的毒株之間氨基酸序列相對保守，HA及NA均只有少數位點的變異，HA蛋白氨基酸序列之間較NA蛋白氨基酸序列之間變異較大；預測HA蛋白具有8個B細胞表位和10個T細胞表位；NA蛋白有12個B細胞表位和7個T細胞表位。結論：HA、NA蛋白的少數區域抗原性相對比較穩定，可以作為檢測以及疫苗研究的靶區域。

【關鍵詞】 H1N1流感病毒； 抗原表位； 血凝素； 神經氨酸酶

2009年4月，在美國首次報道了兩例感染新型甲型H1N1流感病毒患者[1]，同時在墨西哥出現了呼吸道感染的流行[2]。美國爆發的甲型H1N1流感迅速在北美洲地區蔓延，并很快波及亞洲、歐洲。新型甲型H1N1流感病毒是由禽流感、豬流感和人流感三種流感病毒的基因片段間的變異或重組產生的[3]，已經引起世界性的大流行。

甲型H1N1流感能不斷引起流行是由于其抗原性不斷發生漂移所致[4]，其中最重要是血凝素（hemagglutinin，HA） 和神經氨酸酶 （neuraminidase，NA） 的變異[5]。血凝素是流感病毒最重要的蛋白，它的裂解性、受體特異性和糖基化是決定流感病毒感染性和致病性的重要因素。神經氨酸酶是病毒囊膜表面的另一種重要的糖蛋白，在決定病毒毒力和宿主特異性方面也具有重要作用，與HA共為流感病毒亞型分型的主要依據，NA同時也是抗流感病毒的重要作用靶點[6]。目前，國內雖然已經開發了H1N1流感疫苗并接種了2000多萬人，但是，接種所致的不良反應事例的出現同樣給健康的人們帶來了災難。有針對性地改造毒素的相應蛋白、獲得更為安全有效的疫苗成為解決問題的關鍵，而解析甲型H1N1流感病毒HA、NA蛋白的抗原性表位成為關鍵的突破口。

本研究分析了甲型H1N1流感病毒HA、NA蛋白抗原性變化的情況，并對其可能的抗原性表位進行了分析預測，為新型甲型流感疫苗的制備提供依據，以便更有效及時地控制甲型流感的傳播。

1 材料與方法

1.1 新型甲型H1N1流感病毒株HA和NA基因序列與氨基酸序列 從NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/SwineFlu.html）網站下載新近公布的新發甲型H1N1流感病毒的核酸序列與氨基酸序列。從不同國家和地區隨機挑選28株新型甲型H1N1流感病毒株來進行接下來的序列比較和抗原性分析。

1.2 新型甲型H1N1流感病毒的細胞抗原表位預測 用Clustal X軟件分別對28例HA、NA氨基酸序列進行多序列比較，然后使用MEGA 2.0的鄰接法（neighbor-joining method，NJ）構建進化樹，分析彼此之間序列的變異大小。對比序列比對分析結果，選取其中代表性的序列作為基準株，用Protean軟件對基準序列的親水性、表面可能性、抗原指數進行綜合分析，分析各指數值得到B細胞抗原表位預測結果；使用NetMHCⅡ 2.2在線表位預測服務器，選定服務器包含的所有MHC classⅡ等位基因，以9個連續氨基酸為測定單位，根據各序列與MHC classⅡ等位基因的親和能力不同，預測出其可能的T細胞抗原表位。

2 結果

2.1 新型甲型H1N1流感病毒分離株HA、NA氨基酸比較 用MEGA 2.0進行進化樹分析，所得結果見圖1、圖2。從圖1和2可以看出，28例HA以及NA氨基酸序列可以分為兩個大的族群，通過對這兩個族群的氨基酸序列進行分析發現，HA氨基酸序列按220位氨基酸為蘇氨酸或者絲氨酸分為兩個族群；NA氨基酸序列按106位異亮氨酸突變成纈氨酸、248位天冬氨酸突變成天冬氨酰分成兩個大的族群；分別選取兩種蛋白的兩個族群中較有代表性的HA氨基酸序列CY046475與CY044869和NA氨基酸序列CY046477與GQ149691為基準序列以便進行下一步的細胞抗原性表位預測。

圖1 28例甲型流感病毒H1N1 HA氨基酸序列進化樹

2.2 Protean軟件分析基準株HA、NA蛋白B細胞抗原性特征 用Plot-Kyte-Doolittle親水性[7]、Plot-Emini表面可能性[8]、Jameson-Wolf抗原指數[9]三參數綜合考慮預測方案進行B細胞表位預測，HA氨基酸序列CY046475與CY044869的B細胞表位預測結果并沒有明顯差別，同樣，NA氨基酸序列CY046477與GQ149691的B細胞表位預測結果也沒有

注：進化樹后的名稱為GeneBank的登錄號

圖2 28例甲型流感病毒H1N1 NA氨基酸序列進化樹

注：進化樹后的名稱為GeneBank的登錄號

明顯差別，因此，只選取HA氨基酸序列CY046475和NA氨基酸序列CY046477的結果列出。對各個參數進行綜合分析，發現在HA蛋白中50-55、110-120、137-141、175-179、208-222、361-369、457-460、478-500各項指數均較高，提示可能是抗原性表位，見圖3。綜合各參數分析，發現在NA蛋白中1-9、57-60、97-105、137-141、143-150、162-168、210-215、219-222、258-263、273-280、310-323、415-425各項指數均較高，提示為抗原性表位，見圖4。

圖3 HA蛋白 （CY046475） B細胞表位分析結果

圖4 NA蛋白 （CY046477） B細胞表位分析結果

2.3 NetMHCⅡ 2.2軟件分析基準株HA、NA蛋白T細胞抗原性特征 使用NetMHCⅡ 2.2在線T細胞抗原表位預測服務器分析了基準株HA、NA蛋白T細胞抗原性表位，發現HA蛋白中8-16、41-49、61-69、96-104、155-169、215-223、259-267、309-331、346-354、532-542氨基酸區段抗原值較高，見圖5；NA蛋白中32-40、74-85、132-140、155-163、177-185、256-264、351-359氨基酸區域抗原值較高，見圖6，可能為T細胞抗原性表位。

圖5 HA蛋白 （CY046475） T細胞表位分析結果

注：縱坐標的分值表示NetMHCⅡ 2.2軟件預測的9氨基酸滑動肽與各MHC class Ⅱ等位基因的親和力大小

圖6 NA蛋白 （CY046477） T細胞表位分析結果

注：縱坐標的分值表示NetMHCⅡ 2.2軟件預測的9氨基酸滑動肽與各MHC class Ⅱ等位基因的親和力大小

3 討論

甲型（A）流感病毒（influenza virus A）基因組含有8個RNA片段[10]，第1、2、3個節段編碼的是RNA多聚合酶；第4個節段負責編碼血凝素（hemagglutinin， HA）蛋白；第5個節段負責編碼核蛋白（nucleoprotein， NP）；第6個節段編碼的是神經氨酸酶（neuraminidase， NA）；第7個節段編碼基質蛋白（matrix protein， MP）；第8個節段編碼的是一種能起到拼接RNA功能的非結構蛋白，這種蛋白的其他功能尚不得而知。血凝素蛋白和神經氨酸酶被認為是最重要的免疫原性位點[11]。

經過對選自世界各國不同流感病毒株的HA、NA蛋白序列進行Clustal X分析，發現不同株之間氨基酸序列相對保守。HA蛋白最具特征性的變異為220位氨基酸的差別，28株中有15株為絲氨酸和13株為蘇氨酸。對28例NA蛋白中有8例同時發生了106位異亮氨酸突變成纈氨酸、248位天冬氨酸突變成天冬氨酰。總體上來看，HA蛋白的變異性相對于NA蛋白較大。

利用Protean軟件對基準株的HA、NA抗原表位進行預測，聯合使用Kyte-Doolittle的親水性方案，Plot-Emini的蛋白質表面可能性方案及Jameson-Wolf的抗原指數方案進行綜合分析，發現HA蛋白有8段序列，NA蛋白有12段序列是可能的B細胞抗原表位。對220位氨基酸為蘇氨酸的HA蛋白和106位氨基酸為纈氨酸、248位為天冬氨酰的NA蛋白與未發生相應變異的蛋白序列進行比較，發現變異位點并不影響HA、NA蛋白的B細胞表位特征。利用NetMHCⅡ 2.2軟件分析T細胞抗原表位也同樣發現，上述變異位點并不影響HA、NA蛋白的T細胞表位特征。根據以上分析，提示新型甲型H1N1流感病毒關鍵蛋白HA、NA的一些區域抗原性相對比較穩定，可以作為檢測以及疫苗研發的靶區域。

隨著計算機技術的不斷發展，細胞抗原性表位預測方法也得到了很大的進步與廣泛的應用，如表位疫苗的設計、新的診斷試劑開發等。但是細胞抗原性表位預測仍然不夠完善。目前，幾乎所有的細胞抗原性表位預測的算法都是預測連續氨基酸組成的線性表位，而較少涉及構象性表位的研究。本研究僅是對新型H1N1流感病毒的HA和NA蛋白的細胞抗原性表位進行初步篩選，預測結果需要進一步用實驗結果來證實。

參考文獻

[1] Centers for Disease Control and Prevention. Update： swine influenza A （H1N1） infections-California and Texas， April 2009[J].MMWR Morb Mortal Wkly Rep，2009，58（16）：435-437.

[2] Centers for Disease Control and Prevention. Update： novel influenza A （H1N1） virus infection - Mexico， March-May，2009[J].MMWR Morb Mortal Wkly Rep，2009，58（21）：585-589.

[3] Zimmer S M and D S Burke.Historical perspective-Emergence of influenza A （H1N1） viruses[J].N Engl J Med，2009，361（3）：279-285.

[4] Hajjar L A， Schout D， Galas F R， et al. Guidelines on management of human infection with the novel virus influenza A （H1N1）-a report from the Hospital das Clinicas of the University of Sao Paulo[J].Clinics （Sao Paulo），2009，64（10）：1015-1024.

[5] Machala M K and L B Brydak.Various sides of influenza， part I-structure，replication，changeability of influenza viruses， clinical course of the disease， immunological response and laboratory diagnostics[J].Pol Merkur Lekarski，2006，21（123）：270-276.

[6] Su C Y， Wang S Y， Shie J J， et al. In vitro evaluation of neuraminidase inhibitors using the neuraminidase-dependent release assay of hemagglutinin-pseudotyped viruses[J].Antiviral Res，2008，79（3）：199-205.

[7] Kyte J and Doolittle R F.A simple method for displaying the hydropathic character of a protein[J].J Mol Biol，1982，157（1）：105-132.

[8] Karplus P A and Schulz G E.Substrate binding and catalysis by glutathione reductase as derived from refined enzyme：substrate crystal structures at 2 A resolution[J].J Mol Biol，1989，210（1）：163-180.

[9] Jameson B A and Wolf H.The antigenic index： a novel algorithm for predicting antigenic determinants[J].Comput Appl Biosci，1988，4（1）：181-186.

[10] Nicholson K G，Wood J M，Zambon M.Influenza[J].Lancet，2003，362（9397）：1733-1745.

[11] Kash J C， Basler C F， García-Sastre A， et al. Global host immune response： pathogenesis and transcriptional profiling of type A influenza viruses expressing the hemagglutinin and neuraminidase genes from the 1918 pandemic virus[J].J Virol， 2004，78（17）：9499-9511.

（收稿日期：2013-03-28） （本文編輯：連勝利）