大鼠建立氣管異位移植慢性閉塞性細支氣管炎模型后的病理變化及白細胞介素-17的表達

吳維棟 黃麟 吳煒焊

[摘要]目的 探討大鼠建立氣管異位移植慢性閉塞性細支氣管炎模型后的病理變化及不同階段白細胞介素-17（IL-17）的表達情況。方法 選取24只清潔級SD大鼠，其中SPF級近交系Brown Norway（BN）大鼠6只，Lewis大鼠18只，隨機選取12只Lewis大鼠納入對照組，將剩余的6只Lewis大鼠與6只BN大鼠納入觀察組。觀察組BN大鼠提供氣管，Lewis大鼠接受氣管;對照組的12只Lewis大鼠既是供體也是受體。比較兩組大鼠的軟骨損傷率、淋巴細胞計數、大鼠閉塞性細支氣管炎的發生率以及IL-17水平。結果 移植術后，觀察組大鼠閉塞性細支氣管炎的發生率為100.00%，高于對照組的0.00%，差異有統計學意義（P<0.05）。兩組大鼠移植后第7天的軟骨損傷率比較，差異無統計學意義（P>0.05）;觀察組大鼠移植后第14、28天的軟骨損傷率高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）;觀察組大鼠移植第7、14、28天后的淋巴細胞計數多于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。兩組大鼠移植后第7、14天的IL-17水平比較，差異無統計學意義（P>0.05）;觀察組大鼠移植后第28天的IL-17水平高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。結論 通過建立大鼠異位氣管慢性排斥反應模型，提示異位氣管移植后，大鼠的IL-17水平升高，有關IL-17導致的閉塞性炎性反應機制還應繼續試驗與研究。

[關鍵詞]大鼠;異位氣管移植;動物模型;閉塞性細支氣管炎;白細胞介素-17

[Abstract] Objective To investigate the pathological changes and the expression of IL-17 （IL-17） in different stages of chronic bronchiolitis obliterans model after heterotopic tracheal transplantation in rats. Methods Twenty-four clean-grade SD rats were selected， of which 6 were brown Norway （BN） and 18 were Lewis. Twelve Lewis rats were randomly selected into the control group， and the remaining six Lewis rats and six BN rats were included into the observation group. The BN rats in observation group provided trachea， Lewis rats received trachea; and the 12 Lewis rats in control group were both donor and receptor. The cartilage injury rate， lymphocyte count， incidence of bronchiolitis obliterans and the level of IL-17 were compared between the two groups. Results After transplantation， the incidence of bronchiolitis obliterans in the observation group was 100.00%， higher than that in the control group （0.00%）， with statistically significant difference （P<0.05）. There was no statistically significant difference in the cartilage damage rate between the two groups on the 7th day after transplantation （P>0.05）. On the 14th and 28th days after transplantation， the cartilage damage rates in the observation group were higher than those in the control group， with statistically significant differences （P<0.05）. After 7， 14 and 28 days of transplantation， the lymphocyte counts in the observation group were more than those in the control group， with statistically significant differences （P<0.05）. There were no statistically significant differences in the levels of IL-17 between the two groups on the 7th and 14th days after transplantation （P>0.05）. The level of IL-17 in the observation group was higher than that in the control group on the 28th day after transplantation， with statistically significant difference （P<0.05）. Conclusion Through the establishment of the model of chronic rejection of ectopic trachea in rats， it is suggested that the level of IL-17 in rats increased after the transplantation of ectopic trachea， and the mechanism of occlusive inflammatory response induced by IL-17 should be further studied.

[Key words] Rat; Heterotopic tracheal transplantation; Animal model; Obliterative bronchiolitis; Interleukin-17

隨著科技的進步，醫學也在不斷發展，肺移植治療技術也慢慢成熟，最初療效得到了臨床肯定，但是該治療技術存在一定的后期問題，移植手術經過1年和5年的生存率分別為80.0%、50.0%左右[1]。當前面對的難題是有關肺移植手術治療后所出現的慢性排斥反應，它的主要表現就是閉塞性支氣管炎，也就是肺移植治療后發生的進行性小氣道功能紊亂，這種情況具有危險性，嚴重的會危及生命[2]。針對閉塞性細支氣管炎發病的情況還沒有統一的定論，還比較局限，所以建立動物模型研究實驗是很有必要的。臨床對促炎因子的研究比較深入，但是在肺移植之后的慢性排斥反應研究不多，不能證明激活炎性反應的一系列機制，應該繼續深入研究[3]。本文構建大鼠氣管異位移植慢性閉塞性細支氣管炎模型，旨在觀察其病理變化及白細胞介素-17（IL-17）的表達情況，現報道如下。

1對象與方法

1.1實驗動物

選取24只清潔級SD大鼠，購于華中科技大學動物中心，合格證號：99A032。大鼠均為雄性，重量250～350 g，其中SPF級近交系Brown Norway（BN）大鼠6只，Lewis大鼠18只。隨機選取12只Lewis大鼠納入對照組，將剩余的6只Lewis大鼠與6只BN大鼠納入觀察組。本研究已經動物醫學倫理委員會審核批準。

1.2儀器與試劑

冰箱、手術顯微鏡、手術所用的一些器械均由上海醫療器械提供;手術所需要的針線、試劑等均由上海醫用縫合針廠提供。

1.3方法

實驗的整個過程都需要在無菌的條件下進行，實驗前大鼠禁食6 h，并且相關所有共組需要全部消毒。

1.3.1觀察組? ①供體手術：BN大鼠以10%水合氯醛（青島宇龍海藻有限公司，生產批號：20180126，規格：4 ml/kg）腹腔麻醉，頸胸部消毒，正中切口暴露氣管，取下整段主氣管，剝除氣管外膜組織，斷端修剪平整，5環1段為供體，4℃生理鹽水沖洗干凈后浸泡備用[4]。②受體手術：Lewis大鼠麻醉消毒后暴露頸段氣管，環狀軟骨下第4、5環間為中心上下各分離兩環氣管，充分游離氣管后間隙，小心剝離并保護喉返神經[5]。于第4、5環間切開氣管，留膜部1/5部段。吸凈氣管內分泌物后植人入供體氣管。先吻合尾側，膜部對膜部，軟骨部對軟骨部，于12點處以7-0尼龍線縫合1針，打結后剪斷膜部，再于3、9點處各縫合1針，最后縫合6點處[6]。吻合頭側時先縫合膜部，最后縫合12點處完成氣管移植。術后60 d形成OB模型。③術前準備：消毒，選擇和胸骨間隔0.5 cm且支出距離為2.0 cm的切口，將氣管和周圍的組織進行分離，然后下移支氣管，再進行縫合工作，最后消毒，消毒是至關重要的，一切操作都要在無菌條件下進行，為了防止在手術中感染[7]。

1.3.2對照組? Lewis大鼠既是供體也是受體，所有操作與觀察組相同。

1.4觀察指標

比較兩組大鼠的軟骨損傷率、淋巴細胞計數、大鼠閉塞性細支氣管炎的發生率以及IL-17水平。

1.5統計學方法

采用SPSS 19.0統計學軟件對數據進行分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用t檢驗，計數資料以率（%）表示，采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1兩組大鼠閉塞性細支氣管炎發生率的比較

移植術后，觀察組大鼠閉塞性細支氣管炎的發生率為100.00%（12/12），高于對照組的0.00%（0/12），差異有統計學意義（P<0.05）。

2.2兩組大鼠移植后不同時間軟骨損傷率、淋巴細胞計數的比較

兩組大鼠移植后第7天的軟骨損傷率比較，差異無統計學意義（P>0.05）;觀察組大鼠移植后第14、28天的軟骨損傷率高于移植后第7天，淋巴細胞計數多于移植后第7天，差異有統計學意義（P<0.05）;對照組大鼠移植后第14天的軟骨損傷率高于移植后第7天，差異有統計學意義（P<0.05）。觀察組大鼠移植后第14、28天的軟骨損傷率高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）;觀察組大鼠移植第7、14、28天后的淋巴細胞計數多于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）（表1）。

2.3兩組大鼠移植后不同時間IL-17水平的比較

兩組大鼠移植后第7、14天的IL-17水平比較，差異無統計學意義（P>0.05）;兩組大鼠移植后第14、28天的IL-17水平高于移植后第7天，差異有統計學意義（P<0.05）;觀察組大鼠移植后第28天的IL-17水平高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）（表2）。

3討論

閉塞性細支氣管炎常發生于肺移植后，是進行性小氣管功能紊亂疾病，該病的特點是咳嗽、肺功能下降、呼吸困難等，延緩疾病的發展是治療該病的主要方法，不能徹底根治[8-10]。引起閉塞性支氣管炎的原因沒有統一定論，目前臨床認為是由非免疫性損傷、同種異體損傷等造成管腔里纖維細胞增生所致[7]。國外在閉塞性細支氣管炎的有關研究中，將大鼠氣管移植分成3個階段予以研究，與人類肺移植非常相似：①在缺血期做人體肺移植手術時很容易發生出血所導致的缺血癥狀，同時伴隨著上皮細胞死亡，黏膜水腫等癥狀;②出現淋巴細胞性支氣管炎癥狀，主要是由于淋巴細胞被感染導致的;③閉塞性氣道疾病，即上皮細胞死亡消失后，纖維組織將管腔阻塞，人類也是以同樣的方式發生肺移植后的閉塞性支氣管炎[11-13]。

IL-17主要是經過誘導效應細胞，讓其分泌炎性因子，對中性粒細胞產生刺激，從而細胞再生，在炎性反應過程中起到非常重要的作用[14-16]。除此以外，對支氣管泡腔、肺內等不同地方的中性粒細胞也起到一定效果，讓細胞大量地聚集在一起，同時對氣道內皮生長因子起到一定作用，IL-17不僅促進肺移植后氣道的愈合，還能夠增強機體免疫功能[17];同時起到增強中性粒細胞蛋白酶、增強髓過氧化酶等效果。相關研究顯示，控制IL-17分泌能夠減輕肺移植治療中導致的閉塞性支氣管纖維化程度[18-20]。本研究結果顯示，兩組大鼠移植后第7、14天的IL-17水平比較，差異無統計學意義（P>0.05）;觀察組大鼠移植后第28天的IL-17水平高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）;移植術后，觀察組大鼠閉塞性細支氣管炎的發生率為100.00%，高于對照組的0.00%，差異有統計學意義（P<0.05）。提示異位氣管移植后，IL-17水平不斷發生變化，但是其導致的閉塞性炎性機制還要進一步的研究和實驗來證實[15]。

綜上所述，建立氣管異位移植慢性閉塞性細支氣管炎模型后，大鼠的IL-17水平升高，有關IL-17導致的閉塞性炎性反應機制還有待進一步試驗與研究。

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（收稿日期：2019-06-05? 本文編輯：閆? 佩）