銅綠假單胞菌誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞產(chǎn)生MUC5AC的分子機(jī)制

[摘要] 目的 探討銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，Pa）誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)生粘蛋白MUC5AC的影響，并探討其可能的分子機(jī)制。 方法 體外培養(yǎng)NCI-H292細(xì)胞，用Pa感染后，采用ELISA檢測MUC5AC的產(chǎn)生情況；并用商品化的MMP-9活性檢測試劑盒檢測其產(chǎn)生以及酶活性情況。同時，采用EGFR，PI3K，NADPH，ROS 和MMP特異性抑制劑AG1478，LY294002，DPI，NAC和GM6001預(yù)處理NCI-H292細(xì)胞，觀察MUC5AC以及MMP-9的產(chǎn)生情況。 結(jié)果 Pa能以時間依賴性方式誘導(dǎo)NCI-H292細(xì)胞產(chǎn)生MMP-9，并增加其活性。EGFR活化后，經(jīng)PI3K途徑激活Rac1并誘導(dǎo)MMP-9的表達(dá)，最終誘導(dǎo)MUC5AC產(chǎn)生。 結(jié)論 Pa經(jīng)EGFR/PI3K/Rac1/NADPH/ROS/MMP-9通路誘導(dǎo)NCI-H292細(xì)胞產(chǎn)生MUC5AC。

[關(guān)鍵詞] 銅綠假單胞菌；基質(zhì)金屬蛋白酶-9；MUC5AC

[中圖分類號] R562.22 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2013）29-0001-03

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是世界上第四位的主要死亡原因[1]。對于某些患者而言，呼吸道粘液過度分泌是導(dǎo)致COPD急性發(fā)作的重要特征[2]。作為機(jī)體抵御外來病原體感染的重要保護(hù)屏障，粘液是固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分[2，3]。但病理條件下引起的粘蛋白過度表達(dá)往往會導(dǎo)致呼吸受限或換氣不足[2，4]。在已經(jīng)鑒定出的20多種粘蛋白中，以凝膠粘蛋白MUC5AC研究最多[5]。研究表明，MUC5AC在肺部表達(dá)較高，多種細(xì)菌性刺激均可上調(diào)其分泌。本研究旨在探討銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，Pa）誘導(dǎo)人氣道上皮細(xì)胞NCI-H292產(chǎn)生MMP-9的分子機(jī)制，并探討其在誘導(dǎo)產(chǎn)生MUC5AC中的作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與菌株

鼠抗人MUC5AC單克隆抗體購自Sigma。HRP標(biāo)記羊抗鼠多克隆抗體購自Santa Cruz。CM-H2DCFDA為MolecularProbes產(chǎn)品，NSC23766 購自Tocris。特異性抑制劑AG1478（EGFR），LY294002（PI3K）、DPI（NADPH），NAC （ROS），GM6001 （MMP）購自Sigma。Pa和NCI-H292細(xì)胞株購自ATCC。胎牛血清、RPMI1640為Gibco公司產(chǎn)品。

1.2 Pa培養(yǎng)

挑取PA單菌落，在LB液體培養(yǎng)基中37℃下震蕩培養(yǎng)3 h，取200 μL菌液接種至LB瓊脂平板，37℃過夜培養(yǎng)。PBS洗脫平板上細(xì)菌并收集到Eppendorf管中，10 000 rpm離心10 min，PBS洗滌沉淀2次。分光光度計測定菌液OD值（650 nm）并計算細(xì)菌的濃度。

1.3 NCI-H292細(xì)胞培養(yǎng)

人氣道上皮細(xì)胞系NCI-H292細(xì)胞用含10% FBS、100 U/mL青霉素及100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中于5% CO2 37℃的環(huán)境下生長。實驗前，將細(xì)胞按密度為5×105/孔接種于6孔板中。Pa刺激前，細(xì)胞于無血清條件下培養(yǎng)24 h，加入培養(yǎng)的Pa共感染9 h。在研究抑制劑效應(yīng)時，NCI-H292細(xì)胞預(yù)先用相應(yīng)的抑制劑刺激1 h，隨后再用Pa感染。本研究當(dāng)中所用的抑制劑濃度分別為：10 μM AG1478、20 μM GM6001、50 μM NSC23766、50 μM LY294002、15 μM DPI和30 mM NAC。

1.4 明膠酶譜實驗

細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，收集上清，加入Laemmli 樣品緩沖液并經(jīng)含1 mg/mL明膠的SDS-PAGE（分離膠10%）。電泳結(jié)束后，加入含2.5% Triton-X-100復(fù)性液孵育30 min以去除SDS。隨后將凝膠用50 mmol/L HCl（pH 7.4），5 mmol/L CaCl2和1 μmol/L ZnCl2于37℃下孵育過夜。加入0.05%考馬斯亮藍(lán)R-250室溫染色30 min，去離子水脫色，拍照，灰度掃描。

1.5 Rac1活性檢測

裂解處理后的NCI-H292細(xì)胞，根據(jù)Cytoskeleton公司生產(chǎn)的G-LISATM Activation Assay試劑盒的操作說明測量Rac1的活性。本試劑盒采用ELISA原理測量小G蛋白中結(jié)合GTP（活性形式）的含量而加以確定。測量組熒光強(qiáng)度/對照組強(qiáng)度的比值即為Rac1的相對活性。

1.6 ROS檢測

NCI-H292細(xì)胞刺激結(jié)束后，加入10 μM CM-H2DCFDA用于檢測自由基的活性。熒光強(qiáng)度采用熒光分光光度計（Hitachi F-2000）進(jìn)行分析，其中激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為530 nm。ROS含量根據(jù)標(biāo)本熒光強(qiáng)度/對照品熒光強(qiáng)度的比值表示。

1.7 ELISA檢測MUC5AC的產(chǎn)生

采用酶聯(lián)免疫分析測量MUC5AC蛋白的含量。細(xì)胞處理結(jié)束后，棄上清，隨后用4℃ PBS洗滌細(xì)胞。并加入裂解緩沖液（20 mM Tris-HCl，133 mM NaCl，1% NP-40及10%甘油）裂解細(xì)胞。離心獲取裂解上清液并測定其濃度后置于-80℃。檢測MUC5AC時，取裂解上清液置于96孔板中，40℃下烘干。加入2%胎牛血清于37℃封閉1 h，隨后加入含0.05% Tween-20的MUC5AC抗體（PBS稀釋）孵育1 h，結(jié)束后加入二抗，37℃ 1 h。TMB法顯色后，再加入2N H2SO4終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀下讀取450 nm下的吸光度。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

計量資料以（x±s）表示。計量資料采用t檢驗。組間比較采用單向方差分析后行Dunnet t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Pa經(jīng)EGFR誘導(dǎo)NCI-H292細(xì)胞分泌并激活MMP-9

NCI-H292細(xì)胞靜息狀態(tài)下，MMP-9表達(dá)量非常少。當(dāng)經(jīng)Pa感染后，能以時間依賴性方式誘導(dǎo)產(chǎn)生NCI-H292細(xì)胞，當(dāng)感染時間為9 h時，MMP-9含量為對照組的3.7倍。此外，MMP-9的酶活性也隨感染時間的延長而增高。9 h后酶活性是對照組的3.1倍。NCI-H292細(xì)胞經(jīng)EGFR抑制劑AG1478處理后，MMP-9蛋白分泌水平減少52.2%，活性降低61.2%，見表1。

2.2 Pa經(jīng)EGFR和PI3K通路激活Rac1

Pa感染NCI-H292細(xì)胞9 h后，Rac1活性增加了3.8倍。已有研究表明，Pa感染能激活EGFR和PI3K。為了進(jìn)一步探討Rac1的激活與EGFR和PI3K的關(guān)系，NCI-H292細(xì)胞分別與EGFR和PI3K特異性抑制劑AG1478以及LY 294002處理后，結(jié)果顯示，AG1478能將Rac1活性降低了54.5%，LY294002能將其活性降低49.2%。見表2。

2.3 Pa誘導(dǎo)的MMP-9產(chǎn)生與活性的改變受Rac1和ROS調(diào)控

NCI-H292細(xì)胞靜息狀態(tài)下，ROS表達(dá)量較低。經(jīng)Pa感染后，ROS含量為對照組的2.3倍。NADPH和Rac1抑制劑DPI和HSC23766處理后，ROS水平顯著降低（表3）。NCI-H292細(xì)胞感染前用ROS特異性抑制劑NAC預(yù)處理后，MMP-9含量減少了56.7%，活性降低了71.4%。此外，NCI-H292細(xì)胞用Rac1特異性抑制劑NSC23766預(yù)處理，MMP-9的含量與活性分別降低了60.3%，活性降低至68.5%。

2.4 Pa誘導(dǎo)的MUC5AC受Rac1/ROS介導(dǎo)的MMP-9調(diào)控

Pa感染NCI-H292細(xì)胞后，MUC5AC產(chǎn)生量為對照組的3.8倍。NSC23766，DPI或NAC處理后，MUC5AC分泌降低了65.6%、57.9%和50.0%。MMP-9抑制劑GM6001也能抑制44%的MUC5AC產(chǎn)生。

3 討論

盡管有研究顯示Pa能誘導(dǎo)MMP-9產(chǎn)生后調(diào)控MUC 5AC的產(chǎn)生，但其潛在的分子機(jī)制尚不明確[6]。本研究采用Pa細(xì)胞感染NCI-H292細(xì)胞后，能明顯誘導(dǎo)MMP-9的表達(dá)，并導(dǎo)致其活性大大增高，且EGFR特異性抑制劑AG1478處理后顯著逆轉(zhuǎn)該效應(yīng)，這表明MMP-9的產(chǎn)生有賴于EGFR。隨后發(fā)現(xiàn)RGFR抑制后，也能抑制Rac1的活性。且PI3K特異性抑制劑LY294002處理對Rac1也具有一定程度的抑制效應(yīng)，這表明PI3K在介導(dǎo)EGFR激活Rac1中發(fā)揮重要作用。通過采用特異性抑制劑，本研究證實Rac1參與了Pa誘導(dǎo)的MMP-9產(chǎn)生，且PI3K也發(fā)揮重要作用。以上結(jié)果表明Pa感染能通過EGFR途徑促進(jìn)NCI-H292細(xì)胞分泌MMP-9，同時也顯示RGFR下游的信號通路如PI3K依賴性對Rac1介導(dǎo)MMP-9的分泌與激活。

ROS是細(xì)胞當(dāng)中一類生理性物質(zhì)，但在某些呼吸系統(tǒng)疾病如COPD中，是重要的危險因素，而多種病原體可以引起ROS的產(chǎn)生。本研究也證實，NADPH氧化酶也參與了Pa誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生，Rac1和ROS兩者共同調(diào)控MMP-9的分泌與激活[7]。為了進(jìn)一步證明MUC5AC受MMP-9和ROS調(diào)控。給予相應(yīng)的抑制劑處理后，MUC5AC表達(dá)水平顯著降低，再次表明當(dāng)MMP-9激活后，能促進(jìn)MUC5AC產(chǎn)生。

總之，本研究證實MUC5AC的產(chǎn)生受MMP-9調(diào)控，而Rac1在此過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，這為COPD等疾病的治療提供的新的作用靶點(diǎn)。但Rac1是機(jī)體正常生理功能所必須的，尤其是Rac1參與了巨噬細(xì)胞的吞噬功能，這對于機(jī)體清除細(xì)菌感染而言至關(guān)重要[8，9]，因此以Rac1為作用靶點(diǎn)的藥物開發(fā)治療COPD等呼吸系統(tǒng)疾病，必須考慮細(xì)胞特異性的問題，以減少其副作用。

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（收稿日期：2013-08-06）