As2O3及聯合紫杉醇對胃癌MGC803細胞的生長和耐藥性的影響

[摘要] 目的 研究三氧化二砷及聯合紫杉醇對胃癌細胞株MGC803的生長和耐藥性變化。 方法 MTT法觀察MGC803細胞的生長變化；免疫組化檢測p-gp，bcl-2蛋白的表達；電鏡觀察超微結構變化。 結果 隨著As2O3或聯合紫杉醇作用時間的延長，對腫瘤細胞的抑制率逐漸增強，除0.5 μmol/L As2O3作用外，其余各組隨藥物濃度的升高，其抑制率就越高，與對照組比較有明顯差別（P<0.05），且同一As2O3濃度下聯合用藥對腫瘤細胞的抑制作用均強于單一用藥（P<0.05）；免疫組化分析顯示As2O3或聯合用藥能同時下調p-gp和bcl-2蛋白；電鏡下腫瘤細胞出現凋亡改變，并伴有壞死。 結論 三氧化二砷對人胃癌MGC803細胞具有明顯的抑制作用，同時能夠通過下調p-gp，bcl-2蛋白的表達，并且與紫杉醇具有協同作用，延緩耐藥性的發生。

[關鍵詞] 三氧化二砷；紫杉醇；MGC803細胞；生長抑制；耐藥性

[中圖分類號] R735.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2013）29-0004-03

胃癌是消化系統最常見的惡性腫瘤，全世界每年有90萬新發病例，其中我國每年新發胃癌約40萬，占全世界的42%，居所有惡性腫瘤之首，總發病率有上升趨勢[1，2]，胃癌化學治療的效果不甚理想，目前除5-氟尿嘧啶外其他化療藥物對胃癌效果不佳，且多數化療藥有較強的毒副作用和耐藥性問題[3]，因此必須致力于尋找新的化療藥物和方法。As2O3是中藥砒霜石的主要成分，具有顯著的抗腫瘤細胞作用，其作用機制主要是誘導腫瘤細胞凋亡、調控細胞周期、抑制癌細胞生長及誘導細胞分化等[4]，已有研究表明As2O3對多種實體腫瘤都有療效，能體外誘導肝癌、胃癌和橫紋肌肉瘤細胞凋亡和壞死[5]，中藥紫杉醇（paclitaxel， PA）能促進細胞的微管蛋白聚合，抑制解聚，從而抑制細胞有絲分裂，是臨床重要的化療增敏劑，本研究將兩者協同作用于人胃癌MGC803細胞，國內文獻報道甚少，觀察在增敏劑紫杉醇輔助下，As2O3對胃癌細胞的生長抑制作用和對耐藥性的影響，探討可能的機理，為As2O3臨床應用和藥物配伍提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三氧化二砷（As2O3）購自哈爾濱伊達藥業有限公司，紫杉醇系Sigma公司生產，RPMI-1640和胎牛血清由Gibco/BRL公司提供，MTT由上海華舜生物有限公司生產，人胃癌MGC803細胞由哈爾濱醫科大學附屬第一醫院提供， p-gp，bcl-2免疫試劑盒由博士德公司生產，恒溫培養箱，由蘇州安泰技術有限公司生產，透射電鏡EM208由荷蘭生產，OLYMPUS（IX50-S8F2）倒置顯微鏡，酶標儀（型號SAFIRE2）由奧地利生產。

1.2 細胞培養

MGC803細胞接種于50 mL培養瓶中，加入RPMI-1640 培養液（含熱滅活胎牛血清，2 g/LNaHCO3，青霉素和鏈霉素各100 mg/L）中，置于37℃，5%CO2 濃度及飽和濕度恒溫細胞培養箱中培養，細胞為貼壁上皮樣生長，用0.15%胰蛋白酶消化傳代，以培養液吹打制成單細胞懸液，取對數生長期細胞用于實驗。

1.3 實驗分組及其藥物處理

將5×104個/mL單細胞懸液接種于96孔培養板中，陰性對照組加入10 %的完全培養液，實驗劑量組分別加入0.5 μmol/L、1.5 μmol/L、2.5 μmol/L的As2O3培養液，以及As2O3和PA混合液（上述各As2O3濃度分別加入2 μmol/L的紫杉醇），每隔3天更換一次培養液，在不同時間取出細胞做實驗。

1.4 MTT法測定細胞生長抑制率

96孔培養板內加入5×104個/mL單細胞懸液，3℃，50 mL/L CO2孵箱中培養24 h，24 h后棄去培養液，分別加入藥物（不同濃度的As2O3，不同濃度As2O3+PA混合液）200 μL/孔，同一濃度設3復孔，同時設3孔陰性對照，加入等體積的PBS，放入37℃、5% CO2培養箱中培養。在培養24、48、72 h后，各取出一個培養板，吸去上清液，每孔加入無血清的培養液180 μL及20 μl MTT液（用PBS配成50 mg/mL），37℃孵育4 h，棄去上清液，每孔加入150 μL 1 %的DMSO，在微量振蕩器上低速振蕩10 min，酶標儀測量各孔的吸光度值（A 值），按公式抑制率=（1-A 用藥組/ A 細胞對照組）×100%計算，繪制細胞生長抑制曲線。

1.5免疫組化檢測p-gp，bcl-2蛋白的表達

收集上述對數生長期的MGC803細胞，用0.1%胰酶消化成單細胞懸液后，以1×105/mL細胞濃度接種在放有玻片的24孔培養板中，在37℃，5%CO2孵箱中培養24 h后，加入各藥物（濃度同前），對照組則加入等容量的培養液，繼續培養72 h后（研究顯示第三天抑制作用最強），吸盡上清液，PBS洗3次，取出玻片，中性樹膠封片（有細胞面向上），過夜晾干，4 ℃保存備用，免疫組化按試劑盒說明書進行操作，結果判定，排除爬片邊緣的細胞，10×10的低倍鏡下隨機選取10個細胞分布均勻的視野，每個視野在10×20中倍鏡下計數50個細胞，用MPIAS-500病理圖像分析系統測定免疫反應產物的光密度值（OD）行細胞計數。

1.6透射電鏡觀察細胞超微結構

收集對數生長期的MGC803細胞，用含10%小牛血清RPMI-1640培養液配成濃度為1×106個/mL的細胞懸液，取20 mL接種在200 mL的培養瓶中，37℃，5%CO2孵箱中分別培養24 h，細胞貼壁后，棄去含血清的培養液，換成無血清的1640培養液，同時施加藥物（濃度同前），不加藥物的設為空白對照組，用0.15%胰酶消化，離心，棄去上清液，4%戊二醛固定2 h后鋨酸固定1 h，丙酮酸梯度脫水，包埋，醋酸鈾枸櫞酸染色，觀察及攝片。

1.7 統計學方法

數據以（x±s）表示，首先對計數資料進行方差分析，方差分析顯著時進行兩兩比較。采用SPSS 12.0統計學軟件分析，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MTT結果

經統計學分析，0.5 μmol/L的低劑量As2O3抑制率與對照組無明顯差別（P>0.05），1.5 μmol/LAs2O3組抑制率與2.5 μmol/L As2O3組抑制率強于對照組，有統計學差異（P<0.05）；應用As2O3+PA作用于MGC803細胞后，細胞生長受到明顯抑制，均強于相同濃度As2O3單藥組，有統計學差異（P<0.05），且隨As2O3濃度的升高而增強，比較不同濃度給藥組對腫瘤細胞的抑制作用均隨時間延長而增強，結果在第3天時最明顯，而As2O3單藥組第4天有下降趨勢，見表1及圖1～4。

As2O3及聯合紫杉醇對胃癌MGC803細胞的生長曲線（圖1、2、3、4）

2.2 免疫組化結果

見表2。

2.3 透射電鏡觀察結果

對照組細胞：細胞形態完整，表面有豐富微絨毛，胞漿豐富，胞質中異物顆粒較少，多數細胞器形態正常，細胞核較大圓形，核仁明顯；單加As2O3組細胞：很多細胞皺縮，細胞質收縮，整個細胞體積減小隆起呈球形，表面微絨毛減少或消失，聯合加藥組：細胞器減少消失，細胞質皺縮體積減小，晚期形成凋亡小體，其中細胞質中出現明顯異物顆粒，線粒體早期腫大，晚期崩解，滑面內質網減少，表明呼吸鏈受損、合成蛋白質能力下降，部分可見壞死細胞，細胞破裂。

3 討論

胃癌是目前常見的惡性腫瘤，由于生活節奏的加快，飲食多樣化以及食物農藥的殘留等，導致發病率越來越多，多數患者就診時已是晚期胃癌，不宜做手術，化療成為重要的治療手段。但目前化療藥物效差容易產生多耐藥性（MDR），多耐藥性（MDR）產生與癌細胞過剩表達p-gp、MRP、Bcl-2、Bax等基因都有一定的關系。p-gp能將抗癌藥泵出細胞、使細胞內藥物濃度降低，是導致胃癌化療效率停滯不前的重要原因，且化療藥物對機體有嚴重毒副作用，如肝腎損傷、免疫下降、骨髓抑制、消化道反應等，許多患者或因藥物的昂貴放棄治療，或直接死于化療藥物的毒副作用引起的并發癥。自我國[6-9]首先發現亞砷酸（As2O3）具有良好的抗急性早幼粒白血病的作用以來，目前國內外對其抗白血病的機制進行了深入地探討，而且對其抗實體瘤的作用也進行了廣泛的研究。體外實驗已證明亞砷酸對肝癌細胞有明顯的抑制增殖及誘導凋亡作用[10，11]，但三氧化二砷是否對腫瘤細胞有毒性作用取決于其劑量及作用時間。本研究應用As2O3作用于人體外胃癌細胞株MGC803后，發現腫瘤細胞的生長增殖受到明顯抑制，其中0.5 μmol/L的低劑量As2O3抑制率與對照組無明顯差別（P>0.05），1.5 μmol/LAs2O3組抑制率與2.5 μmol/L As2O3組抑制率強于對照組，有統計學差異（P<0.05），單獨As2O3對MGC803細胞第一天抑制作用不明顯，可能是作用時間短，處于抗藥基因表達的時間窗內，致使細胞對化療藥不敏感，從第三天起明顯增強，且濃度愈大抑制作用愈強，第四天又下降，且藥物濃度越高抑制作用越明顯，出現劑量依賴性；以上表明臨床應用As2O3進行胃癌化療應掌握好有效的劑量和療程，以減輕毒性反應；對于As2O3聯合PA用藥組，細胞生長受到明顯抑制，均強于相同濃度As2O3單藥組，有統計學差異（P<0.05），且隨As2O3濃度的升高而增強，比較不同濃度給藥組對腫瘤細胞的抑制作用均隨時間延長而增強，隨著時間的延長，腫瘤細胞抑制率越來越強，并沒有出現單藥組第四天抑制率下降的情況，提示兩者混合用藥能延長腫瘤細胞的抑制時間，延緩耐藥性的出現，能明顯增強化療效果。p-gp是胃癌耐藥的重要基因，胃癌中p-gp陽性率高達58.9%，這可能是胃癌化療差的重要原因，而bcl-2蛋白是Bax家族中重要的抗凋亡基因，免疫組化分析顯示As2O3能同時下調p-gp和bcl-2蛋白的表達，且具有濃度依賴性，聯合用藥組作用強于單一As2O3作用，與對照組比較有明顯差別（P<0.05），說明As2O3能通過減少bcl-2的表達而促進腫瘤細胞的凋亡和抑制p-gp的表達共同延緩胃癌耐藥性的發生，但兩者是否有內在關聯性有待進一步研究，就同一濃度As2O3而言，各組聯合用藥的抑制作用均強于單一的As2O3用藥，可能是PA增加了腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，或是協同誘導腫瘤細胞壞死和加速其凋亡過程[12-14]，對于PA的抗癌機制[15，16]主要是結合到細胞骨架的微管蛋白上，促進微管蛋白的聚集，阻滯其解聚成亞單位，從而抑制有絲分裂的繼續進行，誘導細胞凋亡，體外實驗證明紫杉醇具有顯著的放射增敏作用，可能是使細胞中止于對放療敏感的G2和M期；電鏡下腫瘤細胞出現明顯的凋亡，先是線粒體形態和功能的改變，然后是細胞核的變化，線粒體早期有適應性增生和腫大，晚期外膜崩潰，腫瘤細胞的凋亡可能和As2O3使線粒體膜通透性改變，釋放細胞色素C引起半胱氨酸蛋白酶（caspase）激活有關，同時伴有壞死現象，說明高濃度的化療藥物會引起細胞的壞死，即“過度治療”是有害無益的。以上研究表明三氧化二砷對人胃癌MGC803細胞具有明顯的抑制作用，其第三天抑制作用最強，同時能夠通過下調p-gp，bcl-2蛋白的表達而逆轉胃癌細胞的耐藥性，并且與紫杉醇具有協同作用，因此臨床上可通過兩者配伍，但一定要掌握好適當的有效劑量和濃度，避免過度治療，以減輕藥物副作用和延緩耐藥性的發生，提高胃癌化療效果，但是最佳配伍濃度和化療周期還有待于進一步探索研究。

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（收稿日期：2013-07-15）