嬰幼兒配方乳粉中唾液酸含量的測定

錢振杰，張 恒，陳 敬

(珠海出入境檢驗檢疫局技術中心，廣東珠海 519015)

唾液酸(Sialic Acid，SA)是一類神經氨酸的衍生物，廣泛存在于多種生物組織中，主要包括N-乙酰神經氨酸(Neu5Ac)、N-羥乙酰神經氨酸(NeuGc)和3-脫氧-D-甘油-D-半乳壬酮糖(KDN)等。唾液酸主要的食物來源是母乳，也存在于牛奶、燕窩和雞蛋中［1］。在大部分哺乳動物組織中發現的唾液酸主要是N-乙酰神經氨酸，其在乳中所占質量比例可達到96%左右，因此通常把Neu5Ac稱為唾液酸［2］。唾液酸可通過提高大腦神經細胞的信息傳遞速度促進嬰兒的記憶力和智力發育，還可以提高兒童腸道吸收能力及兒童免疫力，所以部分嬰幼兒配方乳粉的生產廠家以此為商品的宣傳點，將其產品的唾液酸含量標示于包裝之上，一般產品中唾液酸的含量在100～200 mg/100g之間。唾液酸的分析方法很多，主要有分光光度法［3］(UV)、薄層層析法［4］(TLC)、高效液相色譜法［5-7］(HPLC)、脈沖電化學高效陰離子交換色譜檢測法［8］(HPAE-PAD)、膠束電動色譜法［9］(MEC)、毛細管區帶電泳法［10］(CZE)以及高效液相色譜串聯質譜聯用技術［11］(HPLC-MS-MS)等。但是，尚沒有相關產品的相關國家標準。本研究采用液相色譜法，對水解后的嬰幼兒配方乳粉中唾液酸總量的測定方法進行研究，通過系統優化試樣水解、衍生和測定條件，建立乳粉中唾液酸含量測定的液相色譜法。該方法對嬰幼兒配方乳粉中唾液酸的檢測和標示值的確定具有較好的指導意義。

1 儀器與試劑

1.1 儀器與設備

e2695型液相色譜儀，配2475熒光檢測器(美國 Waters);分析天平(瑞士 梅特勒-托利多);HS250 Basic型多功能振蕩器(德國 IKA);HHS21-8-S恒溫水浴鍋(上海新苗)。

1.2 材料與試劑

N-乙酰神經氨酸(Neu5Ac)(含量＞98%，標準品);乙腈、四氫呋喃(色譜純);鄰苯二胺(OPD)、硫酸、氫氧化鈉、硫酸氫鈉及磷酸(分析純);實驗用水為符合GB6682-2008標準規定的一級水。

2 實驗方法

2.1 樣品溶液的制備

稱取約0.2 g～0.3 g(精確至0.001 g)樣品，置于25 mL比色管中，加入20.0 mL硫酸溶液(0.1 mol/L)，充分振蕩搖勻，置于80℃下水浴2 h，冷卻，加入0.625 mL氫氧化鈉溶液(6.0 mol/L)調節pH至近中性，加水定容，搖勻后靜置3 h，直至上層澄清。

2.2 衍生反應

吸取水解后的上層清液1.00 mL置于15 mL離心管中，再加入1.0 mL濃度為5 mg/mL鄰苯二胺溶液(用0.1 mol/L硫酸氫鈉配制)，搖勻后置于80℃水浴下衍生50 min，冷卻，并用0.2 μm一次性針頭式濾頭過濾，裝瓶待測。

2.3 色譜條件

Agilent SB-AQ C18色譜柱(150mm ×4.6mm，5μm);流動相A:乙腈，流動相B相:1%四氫呋喃水溶液(含0.2%磷酸)皆為體積比;柱溫:30℃;流速:1.0 mL/min;進樣體積:10 μL;熒光檢測器激發波長:231 nm，發射波長:465 nm。梯度洗脫程序如下:0 min(8% 流動相A)-5 min(8% 流動相A)-10 min(30%流動相A)-12 min(30%流動相A)-12.1 min(8%流動相A)-18 min(8% 流動相A)。

在上述色譜條件下，唾液酸的參考保留時間為8.35 min。樣品溶液的唾液酸液相色譜如圖1所示。

圖1 唾液酸樣品溶液液相色譜圖Fig.1 Chromatograms of sialic acid sample solution

2.4 線性范圍

分別吸取1.00 mL唾液酸標準工作液系列于15 mL離心管中，按2.2步驟衍生，冷卻過濾，上機檢測。以標準工作溶液濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準工作曲線，見圖2。標準溶液在1.00 μg/mL ～60.0 μg/mL線性范圍之內線性關系良好，線性方程為y=4 915x-1 645.3，相關系數r2為0.999 8。

圖2 唾液酸標準溶液曲線Fig.2 Standard curves of Sialic acid

2.5 精密度試驗

對嬰幼兒配方乳粉樣品進行了6次平行測定，含量及精密度結果如表1所示。此外，通過測定6次平行測定峰面積的標準偏差(SD)與標準曲線方程斜率(k)的比值，我們可得出3倍信噪比(3SD/k)為8.46 mg/100g，故將本方法的檢測限定為10.0 mg/100 g。

表1 唾液酸在乳粉樣品中的本底值的測定Tab．1 Determination results of samples

2.6 加標回收率試驗

取已知含量的嬰幼兒配方乳粉樣品分別加入低、中、高3個濃度水平的N-乙酰神經氨酸對照品溶液。按上述方法進行添加回收實驗，計算3個加標水平的平均回收率和相對標準偏差，結果見表2。

表2 唾液酸在乳粉中的實驗室內回收率和精密度數據Tab．2 Spike recovery rates of sialic acid in milk powder

3 結果與討論

3.1 水解條件的選擇

乳及乳品中的唾液酸主要以3種形式存在:游離態、蛋白結合態以及低聚糖結合態。本研究使用稀硫酸對樣品中所含唾液酸進行水解處理。不同水解時間下待測物的含量結果如圖3所示，60～120 min時間范圍內測定結果基本保持穩定，故本方法選擇水解時間為120 min，以避免乳粉水解不完全的現象發生。

3.2 衍生劑濃度對實驗的影響

唾液酸屬于九碳糖類物質，無紫外吸收峰，但在酸性條件下可與OPD反應，生成有熒光性質的衍生物。唾液酸與鄰苯二胺的衍生反應機理如圖4所示。

本研究針對不同濃度衍生劑存在下待測物的含量進行分析測定，結果如圖5所示。實驗發現高濃度的衍生劑有利于衍生反應正向進行，但同時過多存在的衍生劑也會造成色譜峰拖尾，影響目標物質的分離，故本方法選擇濃度為5 mg/mL的鄰苯二胺為衍生劑進行反應。

圖3 不同水解時間對測定結果的影響Fig.3 Effect of different hydrolysis times

圖4 唾液酸和OPD的衍生反應機理圖Fig.4 Derivatization principles of Sialic acid and OPD

圖5 不同衍生劑濃度對測定結果的影響Fig.5 Effect of different Derivative concentration

3.3 衍生時間對實驗的影響

衍生時間對測定結果的影響如圖6所示。實驗結果表明，衍生時間在40 min之前待測物峰面積隨時間增加不斷增大，當時間超過60 min后則出現略微的下降。因此，最終選擇50 min作為最佳衍生時間。

圖6 不同衍生時間對測定結果的影響Fig.6 Effect of different derivative time

3.4 色譜條件的選擇

使用熒光分光光度計對衍生產物進行光譜掃描，結果如圖7所示。最終我們選擇231 nm作為激發波長，465 nm作為發射波長對衍生產物進行分析。

圖7 熒光檢測器條件的選擇Fig.7 The instrument conditions of Fluorescence detector

4 結論

本研究建立了嬰幼兒配方乳粉的柱前衍生熒光液相色譜檢測方法，對檢測條件進行了優化并對實驗結果進行驗證。該方法快速、簡便，選擇性和準確性高、靈敏度和精密度也滿足實際工作需要，適用于嬰幼兒配方乳粉中唾液酸總量的測定。本方法可作為市售嬰幼兒配方乳粉中唾液酸標簽值正確與否的確認方法，具有很高的實用性。

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