一株拮抗獼猴桃葉枯病的美麗短芽孢桿菌NF2的He-Ne激光誘變育種

付 博，李炎琪，李忠玲，馬 齊，徐升運，高平安，段康民

(1.陜西省科學院酶工程研究所、陜西省酶工程技術中心、陜西省釀造發酵產品質量監督檢驗站，陜西西安 710600;2.西北大學西部資源生物與現代生物技術教育部重點實驗室，陜西西安 710069;3.西北大學物理學系，陜西西安 710069)

近年來獼猴桃細菌性葉枯病成為新興的獼猴桃主要病害，其致病菌為丁香假單胞菌丁香致病變種(Pseudomonas syringae pv.Syringae)，該病原菌一般從葉片內部開始侵染，初期在葉片上形成水漬狀小斑點，隨著病情的加重發展成多角形大病斑，并且病斑的中心逐漸枯死，變為深褐色，病斑的不斷擴大造成葉片內部大部分組織枯死，嚴重影響果樹的生長及果實的品質［1-3］。本課題組研究表明，美麗短芽孢桿菌(Brevibacillus formosus)對獼猴桃葉枯病病原菌具有較好的拮抗作用，同時對其他作物常見真菌性病害也具有良好的抗菌作用，這與該菌株可能產生的抗菌肽、胞外蛋白酶和脂肽類抗生素等活性物質有關［4-5］。為了進一步提高生物防治效果，對野生型菌種進行誘變育種，選育拮抗能力更強的菌株具有重要的現實意義。

目前常用的生物育種方法主要有:誘變育種、基因重組育種和基因工程育種［4］，He-Ne激光誘變是一種高效的誘變育種新技術，激光具有能量密度高、靶點小、單色性和方向性好的特點，激光誘變當代就可出現遺傳性突變。此外低能量的激光還具有促進細胞生長、提高產量、獲得遺傳性能穩定突變株等優勢，因此在微生物育種中得到廣泛的應用［5-7］。

本文以美麗短芽孢桿菌NF2為供試菌，采用He-Ne激光誘變技術，選育對獼猴桃葉枯病拮抗能力提高并能穩定遺傳的突變株，從而提高菌種的應用效果，為實用、新型、高效的生物菌劑的開發奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 菌種

美麗短芽孢桿菌(Brevibacillus formosus)NF2(GenBank登陸號KC495120)，本實驗室分離保藏。獼猴桃葉枯病病原菌，丁香假單胞菌丁香致病變種(編號1336)(Pseudomonas syringae pv.Syringae)，購于中國林業科學研究院森林生態環境與保護研究所。

1.2 培養基

牛肉膏蛋白胨培養基，用于菌株的培養［8］。

1.3 主要儀器

He-Ne激光器(功率0～30mW，波長632.8 nm)，西北大學物理學系提供。SW-CJ-1F型無菌操作臺(蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司)，ZHWY-2102C型搖床(上海智城)。

1.4 美麗短芽孢桿菌NF2生長曲線的測定

將菌株以5%接種量轉接到牛肉膏蛋白胨培養液，30℃，200r/min振蕩培養，2h為時間間隔，測定發酵液在600 nm處的吸光值，繪制生長曲線。

1．5 He-Ne激光誘變育種

1.5.1 誘變菌齡 根據菌株生長曲線，選擇對數生長期末、穩定生長期初的菌體作為誘變對象。

1.5.2 菌懸液的制備 取培養8 h的菌株發酵液，4 000 r/min離心15 min，棄上清，菌體沉淀用無菌生理鹽水制備成濃度為108cfu/mL的菌懸液［9］。

1.5.3 激光照射 取0.2 mL的菌懸液置于無菌玻璃小試管(1.0 cm×7.5 cm)，小試管置于激光束正下方，按照射時間 5min，10min，15min，20min，照射強度5mW，10mW，15mW，20mW，進行組合誘變，未經照射的作為空白對照。照射后吸取0.1mL進行稀釋涂布，每個稀釋度3個平行，進行菌落計數。計算存活率:

1.5.4 拮抗能力的檢測［9］從不同照射組的平皿中分別隨機挑取30個單菌落，以未經照射的原始菌株為對照，按相等的間距將菌種依次接種于含有獼猴桃葉枯病病原菌的培養平板上(每個平板點5個)，30℃培養48 h，觀察原始菌株及誘變菌株的抑菌圈大小(直徑大小分別為Φ1，Φ2)，如果Φ2＞Φ1則視為正突變株，計算正突變率和拮抗效果提高率:

1.5.5 突變株的遺傳穩定性［9-10］連續傳代培養至第15代，每隔一代記錄菌株的抑菌圈直徑(4個平行)，通過SPSS 16.0軟件分析菌株拮抗能力的遺傳穩定性。

2 結果

2.1 美麗短芽孢桿菌NF2的生長曲線

美麗短芽孢桿菌的革蘭氏染色結果見圖1。按1.4所述方法繪制NF2的生長曲線(見圖2)，8h為對數生長期末、穩定生長期初，細胞數量達到最大值，此時芽孢染色檢測發現菌體并未產芽孢，因此選擇菌齡為8h的菌體作為He-Ne激光誘變的研究對象。

2．2 He-Ne激光誘變結果

按照射時間 5min，10min，15min，20min，照射強度5mW，10mW，15mW，20mW，進行組合誘變后，菌株的存活率和正突變率的差異較大(見表1)，但數據的規律性不強。當照射強度為5mW時，菌株的存活率較高，在70%以上。正突變率也較高，其中5～15 min均為46.7%，20min為16.66%。初步得出結論，低強度激光照射有利于保持菌體活性，而且有利于篩選出正突變率較高的菌株。為了進一步驗證，重新設置照射強度為5mW，照射 時 間 10min，15min，20min，25min，30min，35min，40min 進行誘變(由于 5min 照射時間較短，照射誤差較大，穩定性較差，所以驗證試驗中舍去了)。結果顯示(見圖3)，當照射強度為5mW，照射時間為10min時菌株的存活率接近100%，正突變率44%，與第一次實驗結果基本一致，確定菌株 NF2的最佳誘變條件為5mW、10min，計算菌株拮抗效果提高了20.63%(見圖4)。

圖1 美麗短芽孢桿菌NF2的革蘭氏染色Fig.1 Gram staining of Brevibacillus formosus NF2

圖2 美麗短芽孢桿菌NF2的生長曲線Fig.2 Growth curve of Brevibacillus formosus NF2

表1 He-Ne激光誘變對菌株存活率和正突變率的影響Tab．1 The effect on survival rate and positive mutation rate of strain NF2 by He-Ne laser

圖3 低照射強度對菌株存活率和正突變率的影響Fig.3 The effect on survival rate and positive mutation rate of strain NF2 by low intensity irradiation

圖4 He-Ne激光誘變前后對比圖Fig.4 Contrast the difference before and after the He-Ne laser mutation

2.3 誘變后菌株的遺傳穩定性分析

菌株在5mW，10min的He-Ne激光誘變條件下，菌體存活率最高且正突變效果最好。選擇1株誘變效果較好的菌株連續傳代培養至第15代，每隔一代記錄菌株的抑菌圈直徑，通過SPSS 16.0軟件單因素分析菌株拮抗能力的遺傳穩定性(見表2)，P=1.000(＞0.05)統計分析表示總體平均數差異不顯著，說明誘變后各代間菌株的拮抗能力沒有顯著性差異，由此可以證明誘變后正突變菌株的拮抗能力可以穩定遺傳。

表2 誘變后菌株遺傳穩定性的單因素方差分析Tab．2 One-way ANOVA analysis on genetic stability of mutant strain

3 結論

激光作為一種新的誘變劑，對生物體會產生熱、壓力、光、電磁場等多種效應，在微生物遺傳育種中具有廣泛的應用前景［11］。本研究采用He-Ne激光器，對美麗短芽孢桿菌NF2進行誘變，結果顯示菌株NF2的最佳誘變條件為5mW，10min，誘變后菌株拮抗效果提高了20.63%，說明低劑量激光輻射更有利于菌株誘變效果的提高，這與黃建新［14］、祖威［7］等人的研究結果一致。推測這可能是由于激光誘變過程產生的光、熱、壓力和電磁場效應，直接或間接地激活了菌體質粒中攜帶的抗生素基因、或者激活了菌體產生某種酶的能力［9］。

研究顯示，誘變后菌株的拮抗能力可以遺傳穩定至少15代，說明He-Ne激光誘變的菌株穩定性較好。但是，實驗中發現He-Ne激光器在5mW這樣低功率條件下，光束會有一定的能量損失，因此在操作時應提前較長時間對儀器進行預熱和光強度穩定性調整。

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