SP600125對新生期母嬰分離后成年大鼠行為改變的保護作用及機制

摘要：目的 探討JNK特異性抑制劑SP600125對新生期母嬰分離后成年大鼠行為改變的保護作用及機制。方法 復制新生期母嬰分離動物模型。隨機分三組：對照組、母嬰分離組與母嬰分離+SP600125干預組。在2個月時，用三桶互通腦功能儀測定成年后大鼠行為的改變，并采用免疫組化法檢測caspase-3在成年大鼠腦組織海馬中的表達。結果 SP600125組成年后大鼠自發活動的總路程與平均速度較母嬰分離組有所增加，但尚未恢復到對照組水平；海馬組織caspase-3表達量母嬰分離組較對照組明顯增加（P<0.05），SP600125組較母嬰分離組明顯減少（P<0.05），但未恢復至對照組水平。結論 SP600125可能通過抑制JNK信號通路，降低caspase-3的表達，從而改善新生期母嬰分離后成年大鼠的認知障礙。

關鍵詞：新生期母嬰分離；C-Jun蛋白氨基末端激酶；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3

Protective Effects and Mechanism of SP600125 on the Behavior Change in Adult Rats after Neonatal Maternal Separation

DANG Jia-wen， DONG Wen-bin， GUO Lin， KANG Lan

（Luzhou Medical College Affiliated Hospital Neonatology Department， Luzhou Sichuan 646000， China）

Abstract：Objective To investigate the protective effect and mechanism of SP600125 on the behavior change in adult rats after neonatal maternal separation. Methods Neonatal rats were divided into three groups：control group，neonatal maternal separation group，neonatal maternal separation group+SP600125 group. On the two months old，by \"three links exchange apparatus of brain function\" the changes of adult rat behavior were tested； the expression of caspase-3 in hippocampus were detected by immunohistochemical method. Results Compared with neonatal maternal separation group，both the total distance and average speed of locomotor activity were increased in SP600125 group，but not to the same as that of control group. The expression of hippocampus caspase-3 in neonatal maternal separation group increased compared with control group （P<0.05） and that decreased in SP600125 group compared with neonatal maternal separation group （P<0.05），but not to the same as that of control group. Conclusion SP600125 can suppress JNK signal pathway， reduce the expression of caspase-3，so that it improves the cognitive impairment.

Key words：Neonatal mother separation； JNK； Caspase-3

新生兒期母嬰分離是人類生命早期最為常見的應激事件。本課題組前期研究發現，新生期母嬰分離后可引起成年大鼠自發活動減少，導致新生鼠成年后認知障礙，學習記憶能力減退[1]。而海馬組織是學習和記憶的關鍵部位。為此，本研究在前期建立新生期母嬰分離模型基礎上[1]，觀察C-Jun蛋白氨基末端激酶（c-Jun N-terminal Kinase，JNK）抑制劑SP600125干預下海馬細胞中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）表達的影響，探討JNK信號轉導通路在新生期母嬰分離對大鼠成年后認知能力下降中的調控作用。

1資料與方法

1.1一般資料 將同窩新生雄性Wistar大鼠隨機分為三組，即對照組，母嬰分離組（NMS組），母嬰分離+SP600125干預組（SP600125組），每組12只。NMS組、SP600125組建立母嬰分離模型，即于出生后第2～21 d，同時間分離3 h/d。SP600125組于造模第1 d一次性腹腔注射JNK特異性抑制劑SP600125（15 mg/Kg），對照組、NMS組給予等劑量0.9%氯化鈉注射液。飼養至大鼠2個月齡。

1.2觀察指標

1.2.1新生期母嬰分離大鼠成年后行為的變化 采用三桶互通腦功能儀測定大鼠的行為變化，并由紅外線攝像系統和視頻合成器記錄大鼠自發活動，計算機分析系統分析大鼠在腦功能儀運動軌跡、行走速度、距離等。每只大鼠記錄3 min。

1.2.2海馬caspase-3蛋白的表達 采用SP免疫組化法檢測caspase-3蛋白在成年大鼠腦組織海馬中的表達情況，并采用Image-pro6.0圖象分析軟件對圖象進行分析，測定其光密度值（IOD），取平均值作為該切片的光密度值，進行統計分析。

1.3統計學處理 采用SPSS13.0統計學軟件進行數據分析處理，所有實驗數據以均數±標準差（x±s）表示，組間比較用t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1新生期母嬰分離對大鼠成年后行為的影響 與對照組比較，母嬰分離組成年后大鼠在三桶互通腦功能儀自發活動的總路程顯著減少（10.52±3.83 vs 21.41±5.56），平均速度減慢（0.06±0.03 vs 0.12±0.02），差異具有統計學意義（P<0.05）。與母嬰分離組比較，SP600125組成年后大鼠自發活動的總路程有所增加（14.37±6.03 vs 10.52±3.83，P<0.05），平均速度有所加快（0.08±0.05 vs 0.06±0.03，P<0.05），但尚未恢復到對照組水平。

2.2海馬組織caspase-3蛋白的表達 與對照組比較，母嬰分離組大鼠海馬組織caspase-3蛋白的表達明顯增多，差異具有統計學意義（185.51±42.82 vs 112.01±63.74，P<0.05）；與母嬰分離組比較，SP600125組大鼠海馬組織caspase-3蛋白的表達明顯減少，差異具有統計學意義（143.26±38.42 vs 185.51±42.82，P<0.05），但尚未恢復到對照組水平。

3討論

新生兒的組織器官結構和功能未發育成熟， 易發生各種危重癥， 特別是多數早產兒出生后需立即住進新生兒重癥監護病房（NICU）并放入暖箱， 但在生命得到救治同時， 這些新生兒持續處于母嬰分離狀態，處于缺乏母子交流環境中。已證實： 新生兒期MS很可能使該嬰兒神經系統的成熟被阻斷，導致覺醒調節、應激反應、注意力和學習能力的終生損害，對心理行為造成不同程度的影響[2]。因此，探討新生期MS對發育期幼鼠遠期影響及其機制，采取積極有效的防治措施以減少早期負性生活事件所造成的危害具有重要意義。

JNK是絲裂素活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinases，MAPKs）家族成員，被細胞應激、炎性因子信號激活后，其底物ATF-2、c-Jun磷酸化，活化的ATF-2結合到c-Jun啟動子，進而提高c-Jun的轉錄活性，大量活化的c-Jun進一步調節環氧化酶-2（COX-2）的表達，進而啟動細胞凋亡程序，產生損傷效應。JNK信號通路在腦內有豐富的表達，研究證明JNK信號通路在大腦神經元遷移生長、發育、樹突的構建以及損傷后修復等過程中發揮重要作 用[3]。在動物模型中β淀粉樣蛋白可明顯誘導海馬神經元凋亡，同時磷酸化JNK陽性細胞數明顯增多，表明JNK信號轉導通路參與了β淀粉樣蛋白的神經毒性損傷作用，而且與海馬神經元凋亡關系密切[4] 。Jiang等[5]在對新生大鼠海馬和皮質缺血/缺氧的研究中發現，二氮嗪預處理能抑制細胞核JNK的底物c-Jun蛋白的表達增加而減低缺氧復氧后大鼠海馬神經元的凋亡。以上說明JNK信號轉導通路與神經退行性病變或其他神經系統相關疾病有著密切聯系。但JNK轉導通路是否作用于細胞凋亡相關基因caspase-3從而調控新生期母嬰分離后成年大鼠認知能力的改變，目前尚不清楚。

SP600125是JNK特異性抑制劑，通過抑制JNK激活，降低p-c-Jun的表達水平，并阻止其進入核內，進一步抑制bcl-2的激活，從而抑制凋亡程序的啟動，使神經元免于損傷。

本實驗發現，與對照組成鼠相比，母嬰分離組成年后大鼠活動的路程明顯減少、活動速度也減慢，而預先給予SP600125，成年后大鼠活動的路程、速度均較母嬰分離組有所改善，學習記憶能力損害明顯減輕， 說明SP600125可減輕早期母嬰分離對遠期行為發育的損傷，提示JNK信號轉導通路可能在新生期母嬰分離對大鼠成年后認知能力下降中具有調控作用。

Caspases家族是哺乳動物細胞凋亡中的重要分子，其中，caspase-3的激活是凋亡信號的共同途徑和最終執行者，在caspase依賴的細胞凋亡途徑中起著至關重要的作用。caspase-3一旦被激活，即發生下游的級聯反應，使凋亡不可避免，因而caspase-3被稱為\"死亡蛋白酶\"。Caspase基因促細胞凋亡的級聯激活途徑有：①內源性途徑，cyt-c從線粒體釋放到胞漿后與dATP、凋亡蛋白酶激活因子（Apaf-1）結合成復合物，激活Caspase-9，Caspase-9切割后激活Caspase-3；②外源性途徑，Fas膜受體系統激活Caspase-8，Caspase-8直接激活Caspase-3。本研究采用免疫組化方法測定成年大鼠腦海馬組織caspase-3蛋白的表達情況，結果顯示，海馬組織caspase-3蛋白表達量母嬰分離組較對照組明顯增加，SP600125組較母嬰分離組明顯減少。上述實驗結果提示SP600125可能通過下調caspase-3的表達從而改善新生期母嬰分離后成年大鼠的認知障礙。

綜上所述，新生期母嬰分離后成年大鼠的認知能力明顯下降，應用SP600125 能夠減輕對大鼠的這種損害作用，其機制可能與SP600125抑制JNK信號通路，降低caspase-3的表達有關。

參考文獻：

[1]孫鴻燕，朱小霞，等.新生期母嬰分離對大鼠成年后行為的影響及機制[J].中國婦幼健康研究，2011，26（19）：2984-2986.

[2]楊燕珍，吳斌.新生鼠母嬰分離對心理行為的影響及相關機制[J].中國婦幼健康研究，2008，19：479-481.

[3]Li-cai Yang， Quan -Guang Zhang， et al. Extranuclear Estrogen Receptors Mediate the Neuroprotective Effects of Estrogen in the Rat Hippocampus[J].PLoS One，2010，5（5）：9851.

[4]叢偉紅，劉建勛，等.JNK信號通路參與Aβ毒性對大鼠海馬神經元的損傷[J].中國藥理學通報，2010，26（8）：1034-1037.

[5]Jiang KW， Yu ZS， Shui QX， et al. Activation of ATP sensitive potassium channels prevents the cleavage of cytosolic mucalpain and abrogates the elevation of nuclear c-Fos and c-Jun expressions after hypoxicisch emiain neonat rat brain [J].Brain Res Mel Brain Res，2005，133（1）：87-94.

編輯/張燕