esRAGE在慢性腎衰竭患者中的水平及與RAGE基因多態性的關系

摘要：目的 了解esRAGE在慢性腎衰竭患者血清中的水平及其與慢性腎衰竭患者腎功能的相關性，同時對其與RAGE基因多態性的關系進行探討。方法 采集2010年10月～2011年5月于新疆醫科大學第五附屬醫院腎病科住院的慢性腎衰竭患者血75份，其中代償期15例，失代償期21例，腎衰竭期15例，尿毒癥期24例，對照組血清27份。用Elisa方法檢測esRAGE水平，同時檢測肌酐，并提取患者DNA，擴增RAGE基因，再用ALU I限制性內切酶的PCR-RFLP法，觀察RAGE基因多態性與esRAGE水平的相關性。結果 慢性腎衰竭患者血清中esRAGE水平明顯高于正常對照組，其水平與肌酐值呈正相關（r=0.450，P<0.05），RAGE的Gly82Ser位點的多態性以GG型為主，不同分期腎衰竭患者RAGE基因Gbly82Ser等位基因和基因型頻率無明顯差異。結論 慢性腎衰竭患者血清中esRAGE水平腎功損害程度有關，與RAGE基因Gly82Ser位點的多態性無關。

關鍵詞：終末糖基化產物受體；慢性腎衰竭；基因；多態性

終末糖基化產物受體（RAGE）可以與終末糖基化產物結合，將信息傳遞至細胞內后導致下游的生物學效應的發生，目前已有的研究表明它參與了很多疾病的發病機制，如炎癥、血管疾病、糖尿病并發癥等。而esRAGE是近年發現的內源性分泌性RAGE的剪接變體，它可以與終末糖基化產物結合，但由于缺乏胞內段的部分，不能將病理信號傳遞到胞內，因此被認為可以阻止RAGE的許多病理效應，它在冠心病、糖尿病、高血壓人群中的水平降低也支持這一觀點。但近年來一些研究發現，在慢性腎衰竭人群當中，盡管可能并存的高血壓、糖尿病使esRAGE的水平有所降低，但較正常人仍明顯升高。目前國內尚無此類研究，其水平是否與腎功能減退的程度有關，尚不十分清楚，本研究進一步的探討了esRAGE與慢性腎衰竭患者腎功之間的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 采集2010年10月～2011年5月于新疆醫科大學第五附屬醫院腎病科住院的慢性腎衰竭患者血清75份，根據我國黃山會議分期法分期，其中代償期15例、失代償期21例、腎衰竭期15例、尿毒癥期24例（男性43例，女性32例），平均年齡（60±15）歲，對照組選用同期于我院行健康體檢患者，根據其檢查結果篩選出正常對照組27例（男性15例，女性12例），平均年齡（52±10）歲。

1.2研究方法

1.2.1主要試劑 esRAGEELISA試劑盒購自B-BRIDGE公司，蛋白酶K，PCRmix，DNA提取試劑盒購自天根公司，Alu I限制性內切酶購自Thermo公司等。

1.2.2 esRAGE檢測 清晨空腹抽取靜脈血3ml，加入含EDTA的抗凝管，所有標本均復孔檢測。應用酶聯免疫吸附法（ELISA）測定，按試劑盒（美國B-Bridge公司）提供步驟操作，測定波長為450 nm時的吸光度值，根據標準曲線計算esRAGE濃度。

1.2.3 DNA抽提取靜脈血5～10ml，用天根DNA提取試劑盒依照說明書提取DNA，產物用紫外分光光度計檢測OD260/OD280為1.6～1.8，-20℃冷凍準備進行后續實驗。

1.2.4 PCR反應及基因多態性檢測 引物序列為：上游引物5'GTA AGC GGG GCT CCT GTT GCA3'，下游引物5'GGC CAA GGC TGG GGT TGA AGG 3'， PCR反應體系為：反應總體積25ul，DAN模板4ul，上、下游引物各1ul，加雙蒸水至25μl，使用美國BIORADPCR擴增儀。反應條件為：預變性94℃3min，變性94℃30s，退火63℃45s，72℃45s共35個循環，最后72℃延伸7 min，4℃保存。取PCR產物8ul，加人1ulAlul限制性內切酶.10×Buffer 2μl，去離子水9μl，總反應體積20μl，37℃溫育16 h。取酶切產物15μl，2.0%瓊脂糖凝膠進行電泳，溴化乙錠染色，紫外燈下觀察結果，使用凝膠成像系統觀察和記錄結果。GG純合子有248、149 bp兩個條帶，SS純合子有181、67、149bp三個條帶，GS雜合型有248、181、149、67bp四個條帶。

1.3統計學方法 所有數據采用SPSS13.0統計軟件進行統計學處理，計量資料以表示，組間的比較采用多樣本的方差分析。esRAGE與臨床其他指標分別進行Pearson相關分析。計算多態性基因型頻率，確認符合Hardy-Wenberg平衡。計算等位基因頻率。

2 結果

2.1各組esRAGE結果及其與肌酐的關系見表1。

各組esRAGE比較水平有統計學意義，兩兩比較發現，除代償期與正常對照組之間無明顯統計學意義（P>0.05），慢性腎衰竭其他各組較對照組均有明顯統計學意義（P<0.05）， 各組esRAGE與肌酐之間呈正相關（r=0.450，P=0.001，P<0.05）。

2.2各組RAGE基因Gly82ser多態性等位基因及基因型頻率比較（見表2） 各組均可見GG、GS基因型，但均未見SS基因型，RAGE基因Gly82Ser多態性等位基因和基因型頻率均未見明差異（如圖1，見表2）。

圖1 RAGE基因Gly82ser多態性

注：1、2、3均為GG基因型，4為GS基因型

上述結果表明，與正常對照組比較，RAGE基因Gly82Ser等位基因和基因型頻率無明顯統計學意義（P>0.05），提示esRAGE水平與RAGE基因Gly82Ser多態性無關。

3 討論

esRAGE是內源性分泌性終末糖基化產物受體的剪接變體，近年來，研究發現它在慢性心臟病、高血壓、糖尿病患者人群中水平顯著降低[1-3]，由于它缺乏RAGE的胞內段，當它和終末糖基化產物結合時，不會引起胞內的下游的生物學效應的發生，因此，被推測對機體有保護性作用，部分動物實驗通過esRAGE在體內的過表達，也證實了這一觀點[4]。但有學者發現[5]，在慢性腎衰竭這一心腦血管及糖尿病、高血壓高發人群中，esRAGE水平卻明顯升高，其原因目前尚不清楚。本研究通過選取不同階段的慢性腎衰竭患者，對其血清中esRAGE水平檢測后發現，與國外報道一致，慢性腎衰竭患者血清中esRAGE的水平的確明顯高于正常對照組，且這種升高在慢性腎衰竭失代償期才開始逐漸顯現，伴隨著腎功能的惡化，esRAGE也逐漸升高，與肌酐呈明顯的正相關（r=0.450，P=0.001，P<0.05）。提示腎功能是esRAGE的一個強有力的影響因素，這可能由于①慢性腎衰竭時，患者體內的終末糖基化產物由于腎功的減退不能排出體外，因此，刺激相關抗體增多所導致。②慢性腎衰竭患者體內存在微炎癥狀態，這種微炎癥與腎功能的減退程度密切相關，而機體產生過多的esRAGE是對機體的一種自身保護，近年的研究發現老年慢性腎衰竭人群中低esRAGE水平與死亡率密切相關也支持這一觀點[6]。

esRAGE水平的增高是否與RAGE的基因多態性有關，目前還存在不同的觀點，其中研究最多的是Gly82Ser等位基因，但與其他報道一致，本組患者中也主要以GG基因型及GS基因型占優勢，未見SS基因型，在各組人群中G與S出現的頻率無顯著統計學差異，提示兩者無明顯相關。

近年的研究還表明，低水平的esRAGE與慢性腎衰竭心血管死亡率有關，但這還需要更多的人群去驗證。如果這一觀點正確，那么，esRAGE將可能成為新的預測心腦血管死亡風險的Biomarker，同時還可能作為臨床治療此類疾病的新的靶點。

參考文獻：

[1]Falcone C， Emanuele E， D'Angelo A et al. Plasma levels of soluble receptor for advanced glyca -tion end products and coronary artery disease in non-diabetic men[J].ArteriosclerThromb Vasc Biol，2005，25：1032-1037.

[2]Geroldi D， Falcone C， Emanuele E， et al. Decreased plasma levels of soluble receptor for advanc-ed glycation end-products inpatients with essential hypertension[J].J Hypertens，23：1725-1729.

[3]Yonekura H， Yamamoto Y， Sakurai S， et al. Roles of the receptor for advanced glycation end products in diabetes induced vascular injury[J].J Pharmacol Sci 2005，97：305-311.

[4]Bueeiarelli LG， Wendt T， Qu Wu， et al. RAGE blockade stabilizes established atherosclerosis in diabetic apoli-poprotein E-1 mice[J].Circulation，2002，106：2827.

[5]Kalousova M， Hodkova M， Kazderova M， et al. Soluble receptor for advanced glycation end products （sRAGE） in patients with decreased renal function[J].Am J Kidney Dis，2006，47：406-411.

[6]Dalal M， Semba RD， Sun K， et al. Endogenous secretory receptor for advanced glycation end products and chronic kidney disease in the elderly population[J].Am J Nephrol，2011，33（4）：313-318.編輯/王敏