超微粉體夏天無指紋圖譜的研究

【摘要】目的建立夏天無超微粉體的HPLC指紋圖譜，為夏天無的質量控制提供可靠方法。方法采用梯度洗脫進行色譜分離，固定相為diamonsil BDS C18（5μm，250mm×4.6mm），流動相為流動相：A乙腈-B水（每1000mL水中加入冰乙酸30mL，三乙胺8mL），柱溫25℃，流速：0.8mL/min；檢測波長280nm。結果初步建立了夏天無超微粉體的HPLC指紋圖譜，標定了11個共有峰。結論建立的指紋圖譜可以較好地反映夏天無超微粉體的內在質量。

【關鍵詞】夏天無；超微粉體；HPLC指紋圖譜

夏天無為罌粟科植物伏生紫堇 Corydalis decumbens（Thunb）Pers.的干燥塊莖。主產于江西，在湖南、浙江、江蘇等地。為民間常用藥材，具有活血、祛瘀、通絡、行氣等功效，用于中風偏癱、半身不遂等的治療。夏天無主要有效成分為生物堿類，2010年版《中國藥典》將原阿片堿（Pro），鹽酸巴馬汀（Pal）作為其定性和定量指標。但這些成分存在于罌粟科的多種植物中，并非夏天無特有成分，而且僅采用一種或兩種成分對藥材進行定性與定量，不能全面的反映其內在質量。本文采用HPLC法，對夏天無藥材進行了HPLC指紋圖譜研究，建立了一種能較全面地反映藥材質量，并進行質量控制的方法。

1儀器與試藥

Agilent 1200 HPLC（四元泵，自動進樣器，紫外檢測器）；Agilent Technologies 1200 Compact LC化學工作站；BFM-T6BI型貝利微粉機（濟南倍力粉體技術工程有限公司）。

甲醇、乙腈（色譜純，Tedia公司生產），冰乙酸（色譜純，天津光復精細化工研究所），其它均為分析純，水為超純水。

原阿片堿（批號：110853-200402）﹑延胡索乙素（批號：110726-201011）﹑鹽酸巴馬汀（批號：110732-200907）均由中國藥品生物制品檢定所提供。

夏天無藥材共10批（分別購買與湖南、江西等地，經湖南省中藥研究所鑒定均為罌粟科植物伏生紫堇夏天無Coydalis decumbens（Thunb.）Pers.的干燥塊莖。樣品來源見表1。

2.2混合對照品配制取原阿片堿對照品10mg，精密稱定，置50mL量瓶中，加1%鹽酸溶液5mL使溶解，再加甲醇至刻度，搖勻。取鹽酸巴馬汀對照品10mg，精密稱定，置100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。取延胡索乙素對照品10mg，精密稱定，置50mL量瓶中，加1%鹽酸溶液5mL使溶解，再加甲醇至刻度，搖勻。精密量取上述三種溶液各5mL，置同一25mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得（每1mL含原阿片堿40μg、延胡索乙素40μg、鹽酸巴馬汀20μg）。

2.3超微粉體樣品的制備[3-4]稱取夏天無粗粉200g于貝利粉碎機中，在最佳工藝條件下，進行超微粉碎18分鐘，即得夏天無超微粉體。粒徑分布為0.567-153.943μm，D50[5]≤9.684μm，≤75μm的顆粒累積在98%以上。

2.4供試品溶液的制備取不同產地及市售10批夏天無超微粉1.0g，精密稱定，置100mL三角錐形瓶中，加入甲醇50mL，精密稱定重量，加熱回流1小時，放冷后補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液過微孔濾膜（0.45μm）濾過，取續濾液，即得。

3指紋圖譜方法學考察

精密度試驗：精密吸取同一供試品溶液（NO.2，江西2）10μL，按以上色譜條件連續進樣6次，記錄色譜圖，計算其各共有峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD均小于1.6%，表明儀器精密度好。

重復性試驗：取夏天無超微粉（NO.2，江西2）6份，分別按供試品溶液制備方法制備供試品溶液，按擬定方法進樣，記錄色譜圖，計算其各共有峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD均小于1.6%，表明該實驗方法重復性較好。

穩定性試驗：精密吸取同一供試液（NO.2，江西2）10μL，分別在0，6，12，24，48h進樣，記錄色譜圖，計算其各共有峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD均小于1.7%，表明供試品溶液在48小時內測定穩定。

3.1混合對照與樣品HPLC圖譜測定分別精密吸取混合對照與供試品溶液10μL，注入高效液相色譜儀，測定，記錄75分鐘的色譜圖。混合對照色譜見圖1，供試品色譜見圖2。

3.2指紋圖譜的建立[5]

3.2.1共有指紋峰的標定[6]采用相對保留時間標定共有指紋峰，以圖譜中原阿片堿色譜峰為參照物S峰，將各色譜峰保留時間與同一圖譜中參照物的保留時間比較，其比值為各色譜峰的相對保留時間，計算10批夏天無供試品指紋圖譜中各色譜峰的相對保留時間。其中11個色譜峰為各樣品所共有，故標定它們為共有指紋峰。

3.2.2相似度評價采用中國藥典委員會出版的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價》軟件（2.0版）進行相似度計算。

設置第一批樣品圖譜為參照物圖譜，對照圖譜生成方法采用中位數法，時間窗寬度為0.50，多點校正后自動匹配，生成對照指紋圖譜，10批夏天無超微粉體的共有模式指紋圖譜見圖3。相似度計算結果表明，10批供試品的相似度均在0.90以上，見表3。

3.2.3聚類分析應用軟件SPSS 16.0系統聚類法，對10批夏天無超微粉體的HPLC圖譜中各特征峰的相對峰面積進行分析，以歐氏平方距離為測度的聚類圖見圖4。從樹狀圖中可以看出，10個不同產地的夏天無樣品分為3類，10分為I類；6，9分為Ⅱ類；1，2，3，4，5，7，8分為Ⅲ類。

3.3分析與討論

3.3.1提取方法與溶劑的選擇

3.3.1.1生物堿成分提取對不同濃度的提取溶劑（甲醇、50%甲醇、含1%濃氨試液甲醇、含1%濃氨試液50%甲醇溶劑）提取方法（超聲、回流）進行了考察。超聲提取出生物堿成分略低于回流提取，其中甲醇回流提取峰分離較好，達到基線分離，效果最好。因此，選擇甲醇回流提取，并且處理方法操作簡便，快速可行。

3.3.1.2檢測波長的選擇經過查閱文獻，采用紫外吸收波長掃描，在200-400nm波長范圍內進行紫外掃描，色譜圖在280nm處特征性強，具有很好的代表性，故選用280nm作為夏天無生物堿HPLC指紋圖譜的檢測波長。

3.3.1.3聚類分析結果應用軟件SPSS16.0系統聚類法，對10批夏天無超微粉體的HPLC圖譜中各特征峰的相對峰面積進行分析，三類成分相對峰面積系統聚類分析結果比較可知10號（安徽亳州）單獨歸為一類，與含量結果相吻合，其質量較差；6號，9號樣品在三類成分的系統聚類分析中歸屬有差別，其余樣品歸屬均相同。

參考文獻

[1]徐發紅，羅躍華，陳偉康，等.HPLC法同時測定夏天無注射液中3個有效成分的含量.

[2]戴靜波，張佳佳，劉梅夏.天無高效液色譜指紋圖譜研究[J].時珍國醫國藥，2008，19（6）：1437-1438.

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[4]蔡萍，匡建軍，肖娟，等.木香細胞破壁率的測定[J].湖南中醫雜志，2010，26（6）：107-108.

[5]馬宏達，趙慶春，羅舟等夏天無高效液相色譜指紋圖譜研究[J]解放軍藥學學報，2011，27（5）：425-427.

[6]中藥注射劑色譜指紋圖譜實驗研究的技術要求（試行），2004.