應用非衍生化液相串聯質譜法篩查遺傳代謝病高危患兒380例初步分析

【摘要】目的應用液相串聯質譜（tandem mass spectrometry，MS/MS）技術對380例遺傳代謝病（IEM）高危兒童進行篩查，初步了解我國IEM的發病種類和陽性率，為其有效防治提供科學依據。方法采集380例臨床疑似遺傳性代謝病高危兒童濾紙血片，用非衍生化法進行前處理后，采用安捷倫6460串聯質譜儀分析其氨基酸和酰基肉堿濃度。結果發現陽性患兒31例，其中氨基酸代謝病18例（58.1%），脂肪酸代謝疾病8例（25.8%），有機酸血癥5例（16.1%）。結論液相串聯質譜可以快速檢測血濾紙片中的氨基酸及酰基肉堿濃度，是篩查IEM的有效工具。

【關鍵詞】非衍生化液相；串聯質譜法；遺傳代謝病

遺傳性代謝病或先天性代謝缺陷病（inborn errors of metabolism，IEM）是參與體內代謝的某種酶、運載蛋白、膜或受體等編碼基因發生突變，使其編碼產物功能不良而引發代謝失常的一類疾病[1]。它多為單基因遺傳病，由Archibald E.Garrod最先提出這一概念，包括代謝大分子類疾病：溶酶體貯積癥、線粒體病等和代謝小分子類疾病：氨基酸、有機酸、脂肪酸等。國外已經開始全面普及遺傳代謝病篩查，發達國家從上世紀90年代開始大面積普及液相串聯質譜技術用于新生兒篩查，應用該技術可以通過一次實驗同時檢測氨基酸、有機酸及脂肪酸等多種疾病[2]。本研究利用非衍生化串聯質譜（tandem mass spectrometry，MS/MS）法對380例疑似遺傳性代謝病高危兒童進行檢測，了解遺傳代謝病的陽性率，為我國新生兒篩查項目的擴展提供參考。

1資料與方法

1.1研究對象2012年6月至2013年9月河南省鄭州市兒童醫院就診的臨床疑似先天性遺傳代謝性疾病高危患兒380例，其中男176例，女204例。年齡為生后20h至8歲，其中新生兒期146例，嬰兒期150例，幼兒期40例，兒童期44例。

1.2標本收集與保存使用一次性采血針刺足跟或手指，深度小于3mm，將血滴于Scheicher and Schuell 903濾紙樣本卡，血斑正反面一致，室溫下自然晾干呈深褐色，放于封口塑料袋內，保存于2-8℃冰箱中待檢。

1.3試劑和儀器甲醇、乙腈、甲酸胺、甲酸均為高效液相色譜級別，購自Sigma公司。96孔聚丙烯錐形板，96孔過濾板，同位素內標及質控購自PE公司。氨基酸內標11種：2H4-丙氨酸，2H4，13C-精氨酸，2H2-瓜氨酸，15N，2-13C-甘氨酸，2H3-亮氨酸，2H3-蛋氨酸，2H6-鳥氨酸，13C6-苯丙氨酸，13C5-脯氨酸，13C6-酪氨酸，2H8-纈氨酸。酰基肉堿內標13種：2H9-游離肉堿，2H3-乙酰肉堿，2H3-丙酰肉堿，2H3-丁酰肉堿，2H9-異戊酰肉堿，2H6-戊二酰肉堿，2H3-己酰肉堿，2H3-辛酰肉堿，2H3-癸酰肉堿，2H3-十二酰肉堿，2H3-十四酰肉堿，2H3-十六酰肉堿，2H3-十八酰肉堿。上述內標在實驗前用甲醇稀釋成工作液備用。儀器：美國安捷侖公司高效液相色譜儀（Agilent 1600）及6460Triple Quad LC/MS型串聯質譜儀。

1.4測定方法用打孔器將濾紙片打出直徑3mm的圓形濾紙血片，置于96孔過濾板中，每次實驗加入高低兩個質控及一個空白，每孔加入工作液100μL，以封板膜密封，放置于恒溫震蕩儀以700轉/分震蕩45min，然后提取75μL上清液加入另一個96孔聚丙烯錐形板中，鋁箔包裹，即上樣檢測。

1.5儀器設置高效液相色譜儀的流動相采用乙腈和純水，自動進樣器每次進樣2μL，每次測定采用多反應監測方式進行檢測。一個樣品測試約需7min。

1.6數據分析質譜原始數據的定量分析采用自帶軟件Mass Hunter B.05.00進行分析，根據氨基酸和酰基肉堿同位素內標的離子峰強度，計算出所測樣品中氨基酸和酰基肉堿的濃度，并同時計算出比值。

2結果

檢測380份臨床疑似遺傳性代謝病高危兒童血片，診斷遺傳代謝病9種31例，檢出率為8.2%。31例患兒中氨基酸代謝病18例（58.1%），有機酸血癥5例（16.1%），脂肪酸代謝疾病8例（25.8%）。其中氨基酸代謝病18例分別為苯丙酮尿癥（PKU）8例，楓糖尿病（MUSD）3例，高甲硫氨酸血癥4例，同型胱氨酸尿癥1例，精氨酸血癥2例；有機酸血癥5例分別為：甲基丙二酸血癥（MMA）或丙酸血癥（PA）4例，中鏈酰基輔酶A脫氫酶缺乏癥（MCAD）1例；脂肪酸代謝疾病8例包括肉堿轉運障礙（CTD）6例和異戊酸血癥（I）2例。

3討論

先天代謝缺陷病（IEM）多在兒童時期發病，以新生兒期和嬰幼兒期多見，我們的研究中新生兒期和嬰兒期患兒共有336例，占據了所研究患兒的絕大多數，也說明了這一點。遺傳性代謝病病種繁多，目前已發現近1000種，常缺乏特異性的癥狀及體征，并進行性加重，直接或間接影響多個器官系統，特別是腦的發育和功能，導致嚴重傷殘，甚至危及生命。一般嬰兒期發病者主要臨床表現有發育落后（智力、運動、語言），抽搐，肌無力或肌張力增高及喂養困難，進食少，反復嘔吐、腹瀉，黃疸，肝脾腫大等神經系統和消化系統表現；常規實驗室檢查主要表現為：低血糖、高血氨、代謝性酸中毒、尿酮體陽性及腦部損傷。本組380例高危兒童的臨床表現主要有精神運動發育遲緩、高血氨、低血糖、黃疸及難治性酸中毒。

顧學范等[3]用串聯質譜衍生化法對104例IEM高危患兒進行檢測，診斷陽性率為9.6%。本研究采用非衍生化法檢測遺傳代謝病高危兒血片380份，診斷遺傳代謝病（IEM）31例，檢出率8.2%，與其比較接近，表明非衍生化法和衍生化法在疾病檢出率方面沒有太大差異。在實驗過程中，非衍生化法省去吹干、復溶等過程，大大節省了樣本的前處理時間，值得推廣，是新生兒篩查試劑的發展方向。在31例患兒病種分類中，其中氨基酸代謝病18例（58.1%），有機酸血癥5例（16.1%），脂肪酸代謝疾病8例（25.8%），與廣州江劍輝等[4]的遺傳性代謝病病種報道比例（56.4%、20%、27.6%）接近，而與涂文軍等[5]的報道比例（31.3%、45.8%、22.9%）不同，考慮這可能是地區差異，有待更多的實驗來驗證。

大多數遺傳代謝病早期不易發現，容易誤診和漏診，如果沒有得到及時診斷，就會出現不可逆的損傷，給家庭和社會帶來沉重負擔，因此應進一步提高醫師早期識別水平，加強新生兒期篩查，逐漸擴大篩查范圍和篩查病種并進行相關酶學檢測和基因檢測[6]。相信隨著相關技術的發展，會有更多的患兒及早得到診斷及治療。

參考文獻

[1]Saudubray JM，Nassogne MC，de Lonlay P，Touati G.Clinical approach to inherited metabolic disorders in neonates：an overview[J].Semin Neonatol，2002，7（1）：3-15.

[2]Millington DS，Kodo N，Norwood DL，et al.Tandem mass spectrometry：a new method for acylcarnitine profiling with potential for neonatal screening for inborn errors of metabolism.J Inherit Metab Dis，1990，13：321-324.

[3]顧學范，韓連書，高曉嵐，楊艷玲，葉軍，邱文娟.串聯質譜技術在遺傳性代謝病高危兒童篩查中的初步應用[J].中華兒科雜志，2004，42（6）：401-404.

[4]江劍輝，曾偉峰，姜迪剛，李蓓，蔣翔，顧學范，韓連書.748例遺傳代謝病高危兒串聯質譜篩查研究[J].廣東醫學，2008，29（3）：357-359.

[5]涂文軍，戴方，王欣煜，李瑛，何健.液相串聯質譜在遺傳代謝病高危新生兒檢測中運用研究[J].中國優生與遺傳雜志，2010，18（5）：81-83.

[6]應艷琴，羅小平.兒科內分泌遺傳代謝疾病研究進展[J].中國實用兒科雜志，2008，23（5）：343-344.