美洲鰣魚卵巢發育規律和性類固醇激素變化研究

洪 磊，李兆新，陳 超，郭正龍，王蔚芳，雷霽霖

(1.中國水產科學研究院黃海水產研究所，農業部海洋漁業可持續發展重點實驗室，青島市海水魚類種子工程與生物技術重點實驗室，山東青島266071；2.江蘇中洋集團，江蘇南通226600）

1 前言

鰣魚俗稱遲魚，是我國傳統名貴經濟魚類，因其肉細味鮮，營養價值高，明朝時即位列中國四大名魚。由于多年過度捕撈以及江河水質變化等原因，我國鰣魚種群數量銳減[1，2]，1988年已被列入國家一級重點保護野生物種。美洲鰣魚(Alosa sapidissima)原產北美洲大西洋海岸[3]，與中國鰣魚同屬不同種，具有相同的溯河產卵習性，形態特征、魚肉品質和品味等都與中國鰣魚十分相似，在后者瀕臨滅絕的情況下引入我國市場，銷售價格十分可觀，前景良好。目前國內美洲鰣魚相關的研究工作主要集中在繁殖、養殖技術及早期發育管理等方面[4～7]，對親魚卵巢結構、發育及卵子發生方面未見報道。本研究利用組織學、形態學及電化學發光免疫等技術方法，系統研究美洲鰣魚親魚卵巢發育的組織學特征、性類固醇激素（雌二醇）的周期性變化，旨在了解美洲鰣魚卵子發生及內分泌調控規律，以期能為親魚營養強化和人工大規模繁殖提供科學依據，其結果對漁業資源的保護和珍稀魚類開發利用都具有重大的意義。

2 材料和方法

2.1 實驗魚培育

本實驗所用美洲鰣魚樣本來自江蘇中洋集團繁育中心。實驗樣本為達到性成熟的3齡以上雌性親魚，全長(40±5)cm，體重(1.2±0.5)kg。親魚培育水溫(19±2.0)℃，溶解氧＞7mg/L，pH 7.3±0.2，總氨氮＜0.05mg/L，日換水率5%，投喂量為魚體重的3%，每日按時清餌排污。

2.2 組織切片和性腺分期

實驗魚用MS222麻醉后解剖，小心取出性腺，在Davis固定液中固定24 h后轉入70%酒精保存。固定的性腺組織經梯度脫水、透明和石蠟包埋后，用Leica RM 2016型切片機連續切片，厚度為5～7μm，H.E染色，中性樹脂封片。在顯微鏡（Olym-pus BX51）下拍照觀察。根據Мейен的分類標準，結合卵母細胞發育的結構特點，對卵母細胞發育進行分期。

2.3 性類固醇激素測定

使用羅氏ROCHE cobas e601型電化學發光免疫分析儀測定血清中雌二醇（E2）的表達含量，測定數據以pg/m L單位來表示。

2.4 數量特征測量和數據統計分析

對實驗魚進行生物學測量，包括體重（BW）、全長（TL）、性腺重（GW）及肝臟重（LW）等。性腺發育相關指數計算：性腺指數（GSI）=GW/BW×100；肝臟指數（HSI）=LW/BW×100；肥滿度（CF）=[BW/(BL)3]×100。對以上數值進行單因素方差（ANOVA）分析（SPSS軟件，V11.5），檢測變化差異的顯著性。取差異顯著性（P）為0.05，P≤0.05視為差異顯著，反之不顯著。

3 結果與分析

3.1 美洲鰣魚卵巢發育周期變化規律

鰣魚卵巢成對發育，分左右兩葉，位于體腔的腹中線，緊貼于腎臟腹面兩側，在身體后端形成短小的輸卵管(見圖1)。卵巢內有卵巢腔和產卵板，成熟的卵子先突破包圍在它周圍的濾泡膜而跌入卵巢腔，然后經輸卵管從泄殖孔排出體外。卵巢的外部形態和組織結構，隨著年齡的增加、季節和性周期的運轉而變化。根據卵巢外部形狀、色澤及卵母細胞不同的發育時相（切片視野中數量或者面積占優勢的卵母細胞類型）為卵巢劃分依據，將鰣魚的卵巢發育分為6個時期。

圖1 美洲鰣魚卵巢Fig.1 The ovary of Alosa sapidissima

第Ⅰ期，卵巢很小，呈透明線狀，難辨雌雄，卵巢內以卵原細胞為主，終生只出現一次，在親魚卵巢成熟周期調查中不可見。

第Ⅱ期，已分化出完整的雙葉狀結構，長度較第Ⅰ期性腺有所增加，呈前部鈍圓逐漸往后細長延伸的圓錐形，肉紅色，表面被覆一層淡紅色被膜，可見微細的血管，肉眼可初步辨別雌、雄。性腺發育系數為1左右（見圖1a）。肉眼不可分辨卵母細胞，組織切片觀察，卵巢有明顯的卵巢腔，由卵巢表面向腔體內部折疊形成產卵板，大量發育中的卵母細胞封閉在產卵板內。卵巢中以第2時相卵母細胞為主（見圖2a）。

第Ⅲ期，卵巢呈淡黃色，表面血管豐富。卵巢體積明顯增大，總體仍為扁平長囊狀，卵巢上分葉所形成的橫紋明顯，細小的卵母細胞肉眼可見，但不易分離。組織切片觀察，卵母細胞大小不均，第3時相卵母細胞占絕大部分面積，第2時相卵母細胞所占面積很小，多分布于小葉邊緣（見圖1b）。

第Ⅳ期，卵巢為淡黃色或淺桔色，迅速生長，體積明顯膨脹，呈囊狀，左右側卵巢在鰾處有少量重疊，整個體腔幾乎被卵巢充滿，肉眼可見增大的卵粒，顆粒飽滿，卵粒相互粘連，不易游離。以第4時相初期卵母細胞為主，存在部分第2、3時相卵母細胞（見圖1c）。

第Ⅴ期，產卵期卵巢，卵巢極度發育，魚腹表面可見圓柱形隆起，卵巢大、松軟，卵粒大都游離，透明狀。輕輕地擠壓，泄殖孔處有成熟卵粒流出。組織切片觀察，卵巢內除第5時相的卵母細胞外，還含有第3、4時相的卵母細胞（見圖1d）。

第Ⅵ期，即剛產過卵的卵巢，卵巢退化，體積和重量大為減小，松軟癟塌，卵巢腔萎縮。保有未產出的成熟卵及發育未成熟而未產出退化的卵。

3.2 美洲鰣魚卵母細胞形態發育特征及分期

魚類卵子的發生經過增殖、生長和成熟這幾個時期。隨著季節的變化和性周期的運轉，在卵巢的組織發育過程中，可以觀察到處在不同發育階段的生殖細胞。

第1時相，處于卵原細胞階段或由卵原細胞向初級卵母細胞過度的細胞。

第2時相，處于小生長期的初級卵母細胞，呈圓形、橢圓形或多角形，細胞質增長較快，細胞質呈現強嗜堿性，蘇木精染色成藍紫色（見圖2a）。細胞質中出現大而圓的細胞核，略近中央，核膜明顯，核質著色淺，早期核中可見極細，棒狀染色體。核仁多個，分布于核膜內緣。細胞外有單層濾泡膜包被。在較早階段的細胞質中存在與核仁染色相近的團塊狀卵黃核（見圖2b）。

第3時相，初級卵母細胞進入大生長期，其形態基本呈圓球形，細胞體積明顯增大，細胞質呈現弱嗜堿性。核膜呈波狀形，十幾個到數十個不等的細小核仁附在核膜上，一般未見粗大核仁存在。細胞質外緣出現皮質液泡。早期只出現一層松散排列、大小不一的液泡，隨后液泡數目不斷增加并逐漸向內緣移位，從一層、兩層到數層（見圖2c、2d）。到Ⅲ時相晚期，胞質的皮質部分首先出現一些被H.E法染成紫紅色的卵黃顆粒，以后卵黃顆粒逐漸增多，廣泛分布于液泡之間的細胞質中。細胞外的濾泡細胞由單層扁平濾泡細胞期逐漸轉化為雙層扁平濾泡細胞期（見圖2c）、立方形顆粒細胞期（見圖2e）。卵母細胞膜與濾泡細胞之間開始出現放射帶并分化為內外兩層（見圖2d、2e）。

第4時相，處于大生長期晚期的初級卵母細胞，即卵黃充滿期。細胞和胞核直徑均有所增大。小核仁數量增多，多位于核膜內側周邊；核膜形狀不規則。卵黃球逐漸增多，直至幾乎充滿核外空間，只有在核的周圍及靠近卵膜邊緣有較多的細胞質，呈弱嗜堿性。放射帶明顯增厚，相對而言，內層放射帶較厚，外層放射帶較薄，放射帶上的條紋清晰可見。胞外膜可分為濾泡細胞構成的顆粒細胞層及由莢膜細胞、毛細血管等構成的莢膜細胞層（見圖2f、2h）。

第5時相，成熟的卵細胞。核膜破裂并消失，細胞質被卵黃擠到細胞的邊緣。卵黃球散布于整個卵母細胞的胞質內，大多數呈橢圓形，排列十分緊密，有的卵黃球已經融合成卵黃板，呈均質紅染。卵質的邊緣仍有液泡，即將排卵的濾泡膜松馳，大部分與卵膜分離（見圖2i）。

第6時相，細胞形狀不規則，蜷曲于卵巢內，其特征是核消失，卵黃液化。在卵母細胞生長發育的過程中存在卵母細胞萎縮現象（見圖2j）。

3.3 美洲鰣魚卵巢發育過程生物學數據變化

在鰣魚卵巢發育周期，親魚肝臟指數HSI在1.32～2.64范圍內波動，Ⅰ期水平最低，逐漸升高并于Ⅳ期達到峰值，此后降至1.48的水平產卵，與Ⅱ期、Ⅲ期親魚HSI水平基本持平。整個發育周期HSI值差異不顯著。隨著卵巢的發育，親魚肥滿度CF呈逐漸增加的趨勢，Ⅰ～Ⅱ期維持在0.8左右，在Ⅴ期卵巢達到1.1的最大值。CF變化差異不顯著（見圖3）。

圖2 美洲鰣魚卵母細胞Fig.2 The oocyte of Alosa sapidissima

美洲鰣魚雌性親魚性腺指數GSI與血漿中E2的變化如圖4所示。隨著鰣魚性腺開始發育，卵巢增大增重，親魚GSI開始升高，Ⅱ期后發育加速，在產卵期（卵巢Ⅴ期）時達到頂峰。本實驗中卵巢發育Ⅴ期的鰣魚GSI為18.47±1.10，顯著高于卵巢Ⅲ期鰣魚GSI（11.78±0.33），但是與卵巢Ⅳ期鰣魚GSI（14.92±2.04）差異不顯著。在性腺發育過程中E2的變化規律與GSI基本相同，性腺發育早期鰣魚血漿中E2表達水平較低，進入Ⅲ期以后E2表達水平開始上升。本實驗中卵巢發育處于Ⅴ期的鰣魚血漿E2表達水平最高，雖與卵巢Ⅳ期鰣魚E2表達量相比沒有顯著性差異，但是顯著高于卵巢Ⅰ～Ⅲ期鰣魚樣品中E2表達水平。

圖3 美洲鰣魚肝臟指數(HSI)和肥滿度(CF)的變化Fig.3 Hepatosomatic index and condition factor variation of Alosa sapidissima

圖4 美洲鰣魚性腺指數(GSI)和血漿中雌二醇(E2)的變化Fig.4 Gonadosomatic index and plasma 17-estradiol levelsvariation of Alosa sapidissima

4 總結與討論

4.1 美洲鰣魚的產卵類型及卵母細胞發育特征

魚類繁殖的周期性活動可以分為3種類型：完全同步型，部分同步型和不同步型。完全同步型，卵巢內的卵母細胞都處于形同的發育階段；部分同步型，卵巢內至少由兩種處于不同發育階段的卵母細胞群組成，它們在一年內通常只產卵一次，生殖季節相當短；不同步型，卵巢內含有各個發育階段的卵母細胞，一年內產卵多次，生殖季節相當長，如金魚、鳉魚等[8]。研究結果表明，美洲鰣魚卵母細胞的發育呈部分同步型。不同發育階段的卵巢中含有多種時相的卵母細胞，并且在排卵后的卵巢中，除了排卵后殘留的空濾泡膜外，仍然含有一定數量的、發育正常的3、4時相卵母細胞，這與歐洲鰨(Solea solea)[9]、半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)[10]、條斑星鰈(Veras permoseri)[11]的產卵特征一致。當親魚營養積累充足且養殖環境理想的狀態下，在短時間內存在再次排卵的可能，因此美洲鰣魚應該屬于一年產卵一次的部分同步型，也被稱為非同步分批多次產卵類型。

魚類卵子的發生要經過增殖、生長和成熟這幾個時期。卵母細胞的發育要經過原生質生長、卵黃的發生積累等過程，而卵黃發生期的主要特征是卵母細胞胞質中合成卵黃顆粒。本研究發現，美洲鰣魚卵母細胞發育過程中，首先在質膜邊緣出現皮質液泡，進入大生長期后開始出現卵黃顆粒，其后卵黃顆粒數量和體積迅速增加，逐漸充滿整個核外空間。此外，在卵母細胞生長發育的過程中發現有部分卵母細胞不能最終地完成其整個發育過程而出現萎縮的現象，主要表現為各層卵膜分離并逐漸破損溶解，細胞質收縮，細胞內產生大量的空泡，萎縮的卵子最終會被分解吸收。產生萎縮的原因可能是復雜的，主要的原因之一是卵巢在發育的過程中缺乏必需的營養，使第3時相的卵母細胞向第4時相過渡時，卵黃的形成受到阻礙，甚至使第2時相的卵母細胞向第3時相轉變也受到抑制。在此過程中卵黃顆粒膠液化，卵膜發生皺褶，最后斷裂而消失[12]。

魚類的卵膜來源于卵母細胞和濾泡細胞，或由兩者相互作用而形成，其結構從二層到五層不等，而厚度也不相同，浮性卵卵膜薄，卵周隙大；沉性卵卵膜厚，卵周隙小，表現出結構與環境相適應的特點[13]。美洲鰣魚小生長期的卵膜為單層結構，細胞外包圍一層濾泡細胞。隨著卵細胞發育，濾泡細胞逐漸由單層發展為2層扁平狀細胞層，后來發展成內層細胞一般呈立方狀，外層細胞一般呈扁平狀。在第3時相卵母細胞早期未見放射帶形成，當卵母細胞發育到3時相晚期時，出現由卵細胞膜向外形成放射帶結構。至第4時相卵母細胞中、后期時，放射帶厚度明顯增加，出現明暗相間的放射紋。放射帶的保護卵母細胞發育、保持胚胎良好的通氣性和調節滲透壓等生理機能充分顯示出來[14，15]。

4.2 性腺指數、肝臟指數和肥滿度與卵巢發育的關系

性腺指數GSI的快速變化可直接反應出在產卵調控過程中親魚性腺的快速生長和發育。與高體鰤(Serioladumerili)[16]和花鱸(Lateolabraxjaponicas)[17]相似，美洲鰣魚GSI在產卵期快速升高，Ⅴ期卵巢時達到峰值，在非生殖期保持較低的水平，表明性腺對環境因子調控應答機制較好。

肝臟指數HSI可反應魚體內儲存能量的多少，其變化可反映出親魚的攝食情況和肝臟卵黃蛋白原合成的動態變化[18]，因此HSI是評價魚類性腺發育的重要數量指標。本研究表明美洲鰣魚HSI在卵巢發育至Ⅳ期達到峰值，但隨后下降。親魚在產卵期前攝食水平較高而提高能量儲備，在卵黃發生期，魚體儲能被肝臟用于卵黃蛋白原合成和運輸[19]，因此HSI在卵巢發育前期呈上升的態勢。隨著卵巢的發育、膨大，越來越侵占胃腸等其他內臟空間，當接近Ⅴ期排卵期時鰣魚攝食量已大幅下降，而此時卵黃物質仍在加速積累，肝臟儲能被快速消耗，因此出現鰣魚HSI在卵巢發育后期下降的趨勢。暗紋東方鲀在性腺發育中就存在性腺指數愈大，肝臟指數愈小的現象，即隨著成熟度的提高，卵巢逐漸加大而肝臟逐漸減小[20]。

魚類肥滿度CF常用于比較魚類的生長情況，也可作為不良環境狀況的指標。生長是魚類長期攝食、吸收和消耗能量過程的綜合反映。生長緩慢則意味著沒有足夠的能量用于繁殖，可造成個體健康的下降和繁殖力降低。本研究中美洲鰣魚卵巢發育過程中CF基本持平略呈上升趨勢，與其他魚類研究結果比較并沒有廣泛的共性，可能是由于魚類生殖策略的差異導致生殖耗能的差異所致[10]。

4.3 血漿雌二醇水平與卵巢發育的關系

美洲鰣魚血漿E2檢測過程中，卵巢發育Ⅱ期時，親魚處于生長和營養積累階段，檢測的激素處于低水平。隨后親魚性腺處于快速發育期，E2檢測值也表現為急劇上升，從外觀觀察親魚腹部出現膨脹、變硬再變軟最終至排卵的現象。因為美洲鰣魚在人工受精后立即死亡，所以沒有檢測到排卵后血漿E2水平。美洲鰣魚血液E2水平在Ⅲ期后持續升高，Ⅴ期時達到峰值，其變化規律與GSI相同。

5 結語

本研究通過對美洲鰣魚卵巢發育周期組織學觀察發現，美洲鰣魚屬于非同步分批產卵類型；根據卵巢外部形狀大小及色澤等的不同，可將美洲鰣魚卵巢發育過程分為6個時期；根據卵母細胞的形態結構、卵黃物質的積累和濾泡細胞的變化，將卵子發生劃分為6個時相。通過對美洲鰣魚形態學和電化學發光免疫等技術方法檢測發現，在卵巢發育周期肝臟指數HSI先上升后下降在卵巢Ⅳ期達到峰值而肥滿度CF基本呈上升趨勢，但差異都不顯著；性腺指數GSI與血漿中雌二醇E2水平在產卵期快速升高，卵巢Ⅴ期時達到峰值，顯著高于發育前水平，表現出與性腺發育協同一致的變化規律。

[1] 邱順林，劉 琳.長江鰣魚繁殖保護的初步研究[J].淡水漁業，1986(6)：5-8.

[2] 邱順林，黃木桂，陳大慶.長江鰣魚資源現狀和衰退原因的研究[J].淡水漁業，1998，28(1)：18-21.

[3] Jordan D S，Evermann B W.The Fishes of North and M iddle America：A Descriptive Catalogue of the Species of Fish-like Vertebrates Found in the Waters of North America，North of the Isthmus of Panama(Volume 1)[M].U.S.：Government Printing Office，1896.

[4] 劉青華，賈艷菊，高永利，等.美國鰣魚的生物學特性與集約化養殖管理[J].漁業現代化，2006，1：26-34.

[5] 張根玉，朱雅珠，張海明，等.美國鰣魚人工繁殖技術研究[J].水產科技情報，2008，35(5)：221-223.

[6] 洪孝友.美洲鰣早期發育的形態學及組織學觀察[D].上海：上海海洋大學，2011.

[7] 張呈祥，徐鋼春，徐 跑，等.美洲鰣仔、稚、幼魚的形態發育與生長特征[J].中國水產科學，2010，17(6)：1227-1234.

[8] 林浩然.魚類生理學[M].廣東：廣東高等教育出版社，2007，155-213.

[9] Witthames PR，Greer W M.Determinacy of fecundity and at resia in sole(Solea solea)from the Channel，the North Sea and the Irish Sea[J].Aquatic Living Resources，1995，8(1)：91-109.

[10] 柳學周，徐永江，劉乃真，等.半滑舌鰨卵巢發育的組織學和形態數量特征研究[J].漁業科學進展，2009，30(6)：25-35.

[11] 倪 娜，柳學周，徐永江，等.條斑星鰈卵巢發育規律和性類固醇激素周年變化研究[J].漁業科學進展，2011，32(3)：16-25.

[12] 董玉蘭，王樹迎．泰山螭霖魚卵巢年周期中卵母細胞發育及其性腺類固醇激素作用[J]．中國農業科學，2006，39(6)：1264-1271.

[13] 劉文彬，張軒杰.黃顙魚的卵巢發育和周年變化[J].湖南師范大學自然科學學報，2003，26(2)：73-78.

[14] 龔啟祥，曹克駒，曾 崤.香魚卵巢發育的組織學研究[J].水產學報，1982，6(3)：222-234.

[15] 張耀光，謝小軍.南方鯰卵巢濾泡細胞和卵膜生成的組織學研究[J].動物學研究，1995，16(2)：166-172.

[16] Micale V，Maricchiolo G，Genovese L.The reproductive biology of the amberjack，Seriola dumerilii(Risso 1810).I.Oocyte development in captivity[J].Aquaculture Research，1999，30(5)：349-355.

[17] Lee W K，Yang SW.Relationship between ovarian development and serum levels of gonadal steroid hormones and induction of oocyte maturation and ovulation in the cultured femaleKorean spotted sea bassLateolabrax maculatus(Jeom-nongeo)[J].Aquaculture，2002，207(1)：169-183.

[18] Tyler C R，Sumpter JP，Witthames PR.The dynamics of oocyte grow th during vitellogenesis in the rainbow trout(Oncorhynchus mykiss)[J].Biology of Reproduction，1990，43(2)：202-209.

[19] Johnson L L，Casillas E，M yers M S，et al.Patterns of oocyte development and related changes in plasma 17-β-estradiol，vitellogenin，and plasma chemistry in English soleParophrys vetulusGirard[J].Journal of Experimental Marine Biology and Ecology，1991，152(2)：161-185.

[20] 韋 眾，鮑傳和.不同水體河鲀豐滿度、性腺和肝臟指數的比較[J].安徽農業大學學報，1999，26(4)：427-431.