老芒麥種質資源遺傳多樣性的SRAP分析

顧曉燕，郭志慧，張新全，周永紅，白史且，張昌兵，蔣忠榮，劉新，周朝杰，馬嘯*

(1.四川農業大學動物科技學院草業科學系，四川 雅安625014;2.四川農業大學小麥研究所，四川成都，611130;3.四川省草原科學研究院，四川成都611731;4.四川省甘孜藏族自治州畜牧科學研究所，四川康定626000)

研究和了解植物種質間的遺傳變異，對于其在育種上的有效利用非常有益。根據遺傳變異的信息，可以確定具有優異農藝性狀的親本組合［1］，拓寬植物品種的遺傳基礎，防止其育種進程中的漸進性遺傳衰退。另外，遺傳多樣性還可以為物種保護計劃的制定和實施提供參考和借鑒。

老芒麥(Elymus sibiricus)，別名西伯利亞野麥草，是披堿草屬的模式種，為多年生、疏叢型、自花授粉的異源四倍體禾草，具有StStHH的染色體組構成［2］。它是歐亞大陸的廣布種，在北美的阿拉斯加和加拿大北部也有少量分布［3］。老芒麥一般生長于濕潤的草地、河灘、灌木叢中或森林邊緣地帶。在中亞及中國新疆、內蒙古和青藏高原地區，老芒麥作為一種重要的牧草在草地畜牧業中發揮了巨大作用［4-6］。

目前對老芒麥種質的遺傳多樣性研究很少。袁慶華等［7］發現21份老芒麥種質在13個農藝和形態學性狀上存在高度變異。但形態性狀具有不少缺點，如數目有限、易受環境影響和非均勻分布等。DNA分子標記的發展，極大地增加了研究遺傳多樣性的方法，它可以揭示整個基因組上可能存在的大量變異［8］。序列相關擴增多態性(sequence related amplified polymorphisms，SRAPs)是一種簡單的分子標記系統，已經在植物分子作圖和基因定位上被證明其有效性［9］。該技術是基于正向和反向引物對模板DNA的PCR(polymerase chain reaction，聚合酶鏈式反應)擴增，引物具有3個明顯不同的序列框:5'端存在的10～11個隨機堿基序列，緊跟著CCGG(正向引物)或AATT(反向引物)的堿基序列，最后是位于3'端的3個選擇性堿基。從技術的可操作性來看，每個引物5'端的10個隨機堿基序列可以促進任意序列的擴增，即類似于RAPD(random amplified polymorphic DNA，隨機擴增多態性DNA標記)標記的結果［10］。正向引物的CCGG序列可以優先與具有豐富GC堿基的外顯子序列退火結合，而反向引物的AATT序列可優先與具有豐富AT堿基的內含子和啟動子序列退火結合［9］。引物3'端的3個選擇性堿基可以對模板DNA進行選擇，與在AFLP(amplified fragment length polymorphism，擴增片段長度多態性)選擇性擴增中使用的引物的3'端很相似［11］。基于這種獨特的引物設計，SRAP標記具有相對于其他標記更好的重復性、穩定性和簡易性。SRAP 標記已經應用于蕓苔屬(Brassica)［9］、南瓜屬(Cucurbita)［12］、野牛草(Buchloe dactyloides)［13］、紫花苜蓿(Medicago sativa)［14］、黑麥草(Lolium)［15］和芍藥屬(Paeonia)［16］。Budak 等［17］發現在揭示遺傳關系相近的野牛草品種間的遺傳多樣性時SRAP標記比SSR(simple sequence repeats，簡單重復序列)、ISSR(inter-simple sequence repeat，簡單序列重復區間擴增多態性)和RAPD標記更加有效。

比較具有不同地理分布的植物種質，是進化生物學和植物育種學的重要研究內容。因此，老芒麥地理分布的遺傳變異研究，對于收集和管理其種質資源非常重要。然而，目前還未見對不同國家或大的生態區來源的老芒麥種質的遺傳多樣性水平研究的報道。本研究的目的在于:1)評價SRAP標記在老芒麥種質研究中的有效性;2)確定來自于3個國家的84份老芒麥種質間的遺傳關系;3)檢測遺傳多樣性水平與地理來源的關系。這是首次關于利用SRAP標記檢測老芒麥遺傳多樣性的研究報告。

1 材料與方法

1.1 植物材料

84份老芒麥供試種質分別從美國國家遺傳資源庫(NPGS，USDA)、四川農業大學小麥研究所和四川草原科學研究院獲得(表1)。種質的護照信息顯示它們分別采集自俄羅斯(西伯利亞地區為主)、蒙古國、中國新疆、中國的青藏高原地區(川西北高原為主)。每份材料取10～20粒種子，置于有蓋培養皿內的吸水濾紙上萌發。萌發后的種子轉移至內含砂子－泥炭混合基質的盆缽內生長，盆缽置于溫室內。植株生長至開花期進行形態學鑒定，標本憑證保存于四川農業大學草業科學系。

1.2 DNA 提取

每份種質采集5～10個單株的等量新鮮葉片，用液氮研磨成粉，保存于－80℃低溫冰箱內。基因組DNA提取參照Doyle［18］描述的CTAB(hexadecyl trimethyl ammonium bromide，十六烷基三甲基溴化銨)法進行。對比已知濃度的標準λDNA與樣本DNA在0.8%(w/v)瓊脂糖凝膠上的電泳圖譜，利用Quantity One軟件(Bio-Rad，USA)，計算出老芒麥各種質的DNA濃度。將所有樣本的基因組DNA用0.1×TE緩沖液［1 mmol/L Tris-HCl，0.1 mmol/L EDTA(ethylene diamine tetraacetic acid，乙二胺四乙酸)，pH 8.0］稀釋至 10 ng/μL，儲存于 －80℃冰箱內，供SRAP擴增使用。

1.3 SRAP 擴增

引物由上海生工生物工程技術公司合成(表2)。PCR反應混合液(20 μL總體積)由0.2 mmol/L dNTPs，0.3 μmol/L 正向和反向引物，2.5 mmol/L Mg2+，10 × Taq buffer，1 U Taq DNA 聚合酶(北京天根生物技術公司)，40 ng模板DNA組成。擴增在PTC-200熱循環儀內進行(MJ Research，Waltham MA，USA)，采用以下PCR程序:94℃初變性5 min;94℃變性1 min，35℃退火1 min，72℃延伸2 min，共5個循環;在隨后的30個循環中，退火溫度增加至50℃;最后72℃延伸8 min。PCR擴增產物在2%瓊脂糖凝膠(含有0.1 mg/mL的溴化乙錠)上用0.5×TBE(tris-borate-edta，三羥甲基氨基甲烷-硼酸-乙二胺四乙酸)緩沖液進行電泳分離，并用BIO－RAD自動凝膠成像系統照相保存。

1.4 數據分析

只記錄清晰可辨的SRAP擴增條帶，排除弱帶和彌散帶。對所有材料，有帶(即具有相同分子量)記作1，無帶記作0，形成原始二元數據矩陣。

用NTSYS-pc2.11x軟件分析二元矩陣，計算各種質間的Nei和Li［19］遺傳相似系數，利用SAHN模塊，基于UPGMA法進行聚類分析，構建聚類樹形圖。利用NTSYS-pc2.11x軟件基于聚類樹矩陣計算其協表征矩陣(cophenetic matrix)，再利用Mantel檢驗，計算遺傳相似性(GS)矩陣與協表征矩陣間的相關系數，從而反映聚類結果與GS矩陣的符合度［20］。利用WINBOOT軟件［21］基于bootstrap重抽樣法，對聚類樹形圖節點分支的可靠性進行了檢測［22］，設定重復抽樣次數為1000。除聚類分析外，利用NTSYS-pc2.11x軟件，基于GS矩陣還進行了主向量分析(PCoA，principal coordinates analysis)，特征向量以二維形式顯示。PCoA分析可以直觀地觀察各種質間的相關程度，這是因為二維圖上各點之間的距離，反映了各點所代表的各種質之間的遺傳相似性。

表1 老芒麥種質材料地理來源Table 1 List of geographical origin of E.sibiricus germplasm material

續表1 Continued

表2 SRAP正向和反向引物序列Table 2 Sequences of forward and reverse SRAP primers

對每對引物擴增的條帶而言，下列參數即:總擴增帶數(total number of bands，TNB)、多態性帶數(number of polymorphic bands，NPB)、多態性條帶百分比 (percentage of polymorphic bands，PP)、多態性信息量(polymorphic information content，PIC)［也可稱作雜合度(heterozygosity，H)］、條帶信息指數(band informativeness，BI)、分辨力(resolving power，RP)和標記指數(marker index，MI)按下文所述進行計算。PP=NPBs/TNB，PICi=2fi(1 － fi)，式中，PICi是第i個標記的PIC值，fi是擴增帶等位基因(即記為“1”的條帶)的頻率，而(1－fi)是無效帶等位基因(即記為“0”的條帶)的頻率［23］。對每個引物組合而言，計算PIC應該求平均值［或稱之為平均雜合度(average heterozygosity，Hav)，即PICav=Hav=∑PICi/N，式中，N是各引物對產生的多態性帶數(NPB);BIi=1－(2×|0.5－fi|)，式中，BIi是第i個標記的BI值，fi是各種質具有的擴增帶(即記為“1”的條帶)的頻率，而RP=∑BIi。對每對SRAP引物而言，計算BI時應該求平均值，即BIav=∑BIi/N，式中，N是各引物對產生的多態性帶數(NPB)。對每個引物組合而言，標記指數(MI)可以按下述公式計算:MI=NPB×PICav［24］，式中，NPB是每對SRAP引物組合產生的多態性條帶數。

為了解老芒麥種質不同地理類群間和類群內的SRAP變異，利用ARLEQUIN 3.1軟件進行了分子變異方差分析(AMOVA)［25］，計算類群間的遺傳分化系數ΦST。同時利用AMOVA分析，還可以得到不同地理類群間的遺傳距離(稱之為Φ統計量)［26］。方差成分及類群間遺傳距離的顯著性檢測采用9999次隨機置換進行。

2 結果與分析

2.1 SRAP 分析

從140個引物組合中，篩選出23個可以產生清晰可辨條帶的引物組合。這23個引物組合對84份老芒麥種質共產生337條擴增帶，分子量范圍為75～1580 bp(圖1)。其中，203條(60.24%)為多態性帶(表3)。單個引物組合產生的多態性帶為2～19條。平均每個引物組合產生14.7條帶，其中多態性帶為8.8條。單個引物的PIC值在0.151～0.438之間變化，平均值為0.284(表3)。引物組合的平均條帶信息指數值為0.408，變幅為0.230(Em9+Me15)～0.696(Em12+Me16);23個引物組合的標記分辨力(RP)的變幅為1.119(Em12+Me5)～9.333(Em1+Me10)，平均值為3.631。具有較高的分辨力和標記指數的引物組合一般同時具有較高的多態性，能夠辨別更多的種質。

圖1 引物組合Me5+Em19對84份老芒麥種質的擴增帶型Fig.1 SRAP profile of E.sibiricus collections amplified using the primer pair Me5+Em19

2.2 種質間的遺傳相似性

84份種質間的遺傳相似性(GS)系數變幅為0.783(204251與PI610886)～0.965(205119與205151)，平均值為0.865。圖2描述了3486個GS值的頻數分布。前2個最高的GS值頻數分別分布在0.886～0.891和0.880～0.885。約95%的 GS值分布在0.810 ～0.921之間，只有0.8%的 GS值高于0.93，同時也只有0.1%的 GS值低于0.80。這說明供試材料間的遺傳關系較近。

2.3 聚類系統樹和主向量分析(PCA)對種質的劃分

基于SRAP標記的UPGMA系統樹(圖3)，揭示了84份老芒麥種質間的遺傳關系。系統樹可以在不同的GS水平上將供試種質劃歸為不同的組群。在GS=0.84的水平上，供試種質可以被劃分成2個明顯不同的組群。第Ⅰ組群包括來自于俄羅斯(20份)、蒙古(16份)和中國新疆(23份)的種質。第Ⅱ組群包括全部來自于青藏高原的25份種質。第Ⅱ組群又可劃分為3個亞組:亞組1包括甘肅種質3份、青海種質2份，西藏種質1份;亞組2包括13份四川種質和2份甘肅種質;亞組3包括3份四川種質和1份西藏種質。協表征矩陣與GS矩陣間的相關系數達0.88，說明聚類結果與原始GS矩陣能較好地吻合。基于Bootstrap分析所得的對系統樹分支節點置信度的支持值(bootstrap value)被標注在圖3中聚類圖上。共有19個分支節點具有高于50%的置信度。第Ⅰ和第Ⅱ組分支節點被91%和100%的bootstrap值支持，表明了青藏高原來源的種質類群(Ⅱ)與其他地理來源的種質類群(Ⅰ)具有明顯差異。

表3 23對SRAP引物對84份老芒麥種質產生的總擴增帶數(TNB)、多態性帶數(NPB)、多態性條帶百分比(PP)、多態性信息量(PIC)、條帶信息指數(BI)、條帶分辨力(RP)和標記指數(MI)Table 3 Total number of bands(TNB)，number of polymorphic bands(NPB)，percent polymorphism(PP)，polymorphic information content(PIC)，band informativeness(BI)，resolving power(RP)and marker index(MI)of the 23 primer combinations used to generate SRAP markers in 84 E.sibiricus accessions

圖2 基于203條多態帶計算出的84份老芒麥種質間的遺傳相似系數的分布Fig.2 The distribution of genetic similarities among 84 E.sibiricus accessions based on SRAP data

基于84份種質GS矩陣的主向量分析(PcoA)的結果表明，第1和第2主向量分別可以解釋16.7%和5.8%的遺傳變異。依據圖4上各種質間的空間關系，可以直觀地看出84份材料被明顯劃分成兩大組，其中青藏高原組又可劃分成3個亞組。這與UPGMA聚類結果保持一致。

圖3 基于SRAP數據利用UPGMA法獲得的老芒麥種質的聚類樹形圖Fig.3 Dendrogram of E.sibiricus accessions based on SRAP data using UPGMA method

圖4 基于SRAP數據描述84份老芒麥種質間遺傳關系的主向量分析Fig.4 Two-dimensional principal coordinate analysis depicting genetic relationships among 84 E.sibiricus accessions based on SRAP data

2.4 老芒麥地理類群的遺傳結構分析

根據采集地及其生態條件的差異，可以將供試種質劃分為四大類群，即青藏高原、新疆、蒙古和俄羅斯類群。基于擴增帶(記為1的帶)和無效帶(記為0的帶)的頻率，對群體遺傳結構進行了分析。AMOVA分析結果顯示:在總的遺傳變異中有79.62%發生在類群內，有20.38%發生在類群間(ΦST=0.204)，群體間和群體內的變異均為極顯著(P ＜0.0001)(表4)。

表4 4個老芒麥地理類群的分子方差分析(AMOVA)Table 4 Analysis of molecular variance(AMOVA)of four germplasm groups of E.sibiricus

2.5 老芒麥地理類群的聚類分析

基于AMOVA分析，可以得到類群間兩兩比較的ΦST值，它可以代表標準化的類群間遺傳距離(pairwise ΦSTdistance)(表5)。青藏高原類群與其他類群間的遺傳距離均比較大，而剩余3個類群間的遺傳距離比較小。類群間成對ΦST的變幅為0.0371(蒙古類群與俄羅斯類群間)～0.3547(蒙古類群與青藏高原類群間)。為更好地了解各類群間的遺傳關系，利用表5中的ΦST距離，進行UPGMA聚類分析(圖5)。4個地理群被明顯劃分成兩支，一支為青藏高原類群，另一支包括蒙古、俄羅斯和新疆類群。青藏高原類群明顯區別于其他3個類群，這與對84份種質的UPGMA聚類結果一致(圖3)。

圖5 基于AMOVA獲得的遺傳距離對4個老芒麥地理類群的UPGMA聚類Fig.5 UPGMA clustering of four geographic groups of E.sibiricus using genetic distances generated from AMOVA

3 討論

3.1 SRAP標記的多態性和變異

形態－農藝性狀和生化標記(同工酶和種子貯藏蛋白)是評價植物種內遺傳多樣性的常用手段［7，27-30］。由于不受環境影響、不受限于植物的發育階段，分子標記目前已成為遺傳多樣性評價的強有力的主流研究手段。雖然目前有關利用分子標記研究老芒麥種質遺傳變異的報道很少，但RAPD、SSR、AFLP、PCR－RFLP等DNA分子標記已廣泛用作披堿草屬植物的群體遺傳結構和種間系統進化研究［31-34］。SRAP標記綜合RAPD標記的簡便性和AFLP標記的高多態性和穩定性于一身，其上下游通用引物可以搭配使用，極大地提高了引物的利用效率，是一種進行遺傳多樣性評價、品種鑒定和系統進化研究的有效工具［9，13］。本研究得到的老芒麥種質的SRAP多態性比率(PP)為 60.24%，低于已報道的禾本科植物野牛草(95%)［13］和鴨茅(Dactylis glomerata)(84.4%)［35］，而且也低于對青藏高原地區老芒麥SRAP研究的結果(86.48%)［36］。本研究利用23個引物組合共擴增出337條帶，其中多態性帶203條，平均每個引物組合擴增多態性帶8.8條，說明SRAP的擴增產率較高，非常適合對大規模種質的遺傳變異檢測。由于SRAP可以采用更加靈敏的聚丙烯酰胺凝膠銀染或熒光標記來檢測擴增帶，而本實驗采用的是較為簡便的瓊脂糖檢測法，這可能是本研究所得的多態性比率較低的部分原因。

84份老芒麥種質間的平均遺傳相似系數(GS)為0.865，表明供試材料間具有較近的遺傳關系，這很可能與老芒麥的繁育方式相關。一般來說，相對于異花授粉和常異花授粉植物而言，自花授粉植物具有較高的群體間遺傳變異和較低的群體內遺傳變異［37］。由于老芒麥存在較高的異交率，并非嚴格的自花授粉植物，屬于常異花授粉植物，所以每份種質都可以看作是一個內部存在較高變異的小群體，而本實驗采用的是混合單株提取DNA法(bulked DNA)，可能會掩蓋種質內的遺傳變異，降低決定種質間遺傳關系的多態性帶的數目;加上種質間在繁殖后代過程中存在一定的基因流(花粉流)［38］，這兩種因素可能會在一定程度上降低種質間的遺傳差異，導致種質間較高平均GS值的出現。根據地理來源的不同，將供試種質劃分為四大地理類群。地理隔離、生態隔離和繁殖隔離會極大地影響植物的種內遺傳多樣性［39］。所以青藏高原類群與其他3個類群種質間平均GS值均較小，其原因可能是青藏高原與其他三地區的生態地理環境存在的巨大差異所致。

本研究運用AMOVA分析的結果表明:老芒麥地理類群內的遺傳變異占總變異的79.62%，類群間的遺傳變異占總變異的20.38%，基于Shannon指數的分析結果與AMOVA分析結果非常接近。另外在4個地理類群中，青藏高原類群具有最高的Shannon多樣性(Ho=0.2398)。這表明進行老芒麥遺傳資源的挖掘利用時，應更多地重視本地優異資源特別是青藏高原地區資源的收集、保護及隔離繁種。

3.2 供試種質間及其地理類群間的遺傳關系

根據表現所有供試種質間遺傳關系的聚類樹形圖和主向量空間分布圖來看，各種質的聚類分布與地理來源有較強的關系［40］。種質的地理來源代表了不同的宏觀生態環境，而這些不同的生態環境條件是造成種質間的遺傳變異的主要因素［41］。本研究供試種質被分成兩大類的原因，可能主要依賴于青藏高原種質的特有生態地理適應性。由于青藏高原的高海拔及它被喀喇昆侖山、阿爾金山和祁連山等著名高山與其他種質的來源地區隔離開來［42］，造成其植物種質可能具有特定的生態地理適應性。需要注意的是，來自于新疆、蒙古和俄羅斯的種質并沒有按地理來源被清晰的分開，可能與這3個國家或地區接壤且并無明顯生態條件差別有關。另外，種質繁殖后代過程中的遺傳交換可能會加劇種質間的遺傳相似性。同樣，基于AMOVA分析產生的類群間ΦST值的聚類分析也反映了相似的實驗結果。雖然AMOVA分析表明地理類群間的變異僅占總變異的20.38%，但達到了極顯著水平，這從另一個側面反映了青藏高原種質類群與其他類群間存在較大的遺傳差異。本結果與Chen等［43］、陳智華等［44］和苗佳敏等［45］對垂穗披堿草(Elymus nutans)遺傳多樣性的研究結果一致，即青藏高原與其他地區的種質材料存在明顯的遺傳分化。特別提及的是，由于AMOVA可以計算無法估計是否處于Hardy-Weinberg遺傳平衡狀態或人為劃分的植物類群或群體間的ΦST值作為其遺傳距離，因而在評價類似植物群體間和群體內的遺傳關系時非常有效［46］。如果采用POPGENE等軟件強行基于H-W遺傳平衡來計算人為劃分群體(如地理類群)的遺傳分化，可能存在較大誤差。

本研究的結果表明SRAP是評價老芒麥種質資源遺傳變異的有效手段。今后應增加利用SSR等標記手段以檢測非編碼區的遺傳變異，綜合評價現有老芒麥種質在全基因組水平上的遺傳多樣性，為種質保護、利用和品種選育提供有益的信息。

［1］Moreno-González J，Cubero J I.Selection strategies and choice of breeding methods［A］.In:Hayward M D，Bosemark N O，Romagosa I.Plant Breeding，Principles and Prospects［M］.London:Chapman ＆ Hall，1993:281-313.

［2］Dewey D R.Cytogenetics of Elymus sibiricus and its hybrids with Agropyron tauri，Elymus canadensis，and Agropyron caninu［J］.Botanical Gazette，1974，135:80-87.

［3］Bowden W M，Cody W J.Recognition of Elymus sibiricus L.from Alaska and the district of Mackenzie［J］.Bulletin of the Torrey Botanical Club，1961，88:153-155.

［4］道來提，麥耒.新疆老芒麥的馴化［J］.中國草地，1988，(4):48-50.

［5］王元富，盤朝邦，楊智永.川草1號老芒麥選育報告［J］.四川草原，1994，(4):7-13.

［6］張眾，王比德，吳渠來，等.農牧老芒麥的選育推廣及其栽培利用［J］.中國草地，1995，(4):29-32.

［7］袁慶華，張吉宇，張文淑，等.披堿草和老芒麥野生居群生物多樣性研究［J］.草業學報，2003，12(5):44-49.

［8］Melchinger A E，Graner A，Singh M，et al.Relationships among winter and spring cultivars revealed by RFLP’s［J］.Crop Science，1994，34:1191-1199.

［9］Li G，Quiros C F.Sequence-related amplified polymorphism(SRAP)，a new marker system based on a simple PCR reaction:its application to mapping and gene tagging in Brassica［J］.Theoretical and Applied Genetics，2001，103:455-461.

［10］Williams J G K，Kubelik A R，Livak K J，et al.DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers［J］.Nucleic Acids Research，1990，18:6531-6535.

［11］Vos P，Hogers R，Bleeker M，et al.AFLP:A new technique for DNA finger printing［J］.Nucleic Acids Research，1995，23:4407-4414.

［12］Ferriol M，Pico B，Nuze F.Genetic diversity of a germplasm collection of Cucurbita pepo using SRAP and AFLP markers［J］.Theoretical and Applied Genetics，2003，107:271-282.

［13］Budak H，Shearman R C，Parmaksiz I，et al.Molecular characterization of buffalograss germplasm using sequence-related amplified polymorphism markers［J］.Theoretical and Applied Genetics，2004，108:328-334.

［14］Vandemark G J，Ariss J J，Bauchan G A，et al.Estimating genetic relationships among historical sources of alfalfa germplasm and selected cultivars with sequence related amplified polymorphisms［J］.Euphytica，2006，152:9-16.

［15］李杰勤，王麗華，詹秋文，等.20個黑麥草品系的SRAP遺傳多樣性分析［J］.草業學報，2013，22(2):158-164.

［16］Han X Y，Wang L S，Shu Q Y，et al.Molecular characterization of tree peony germplasm using sequence-related amplified polymor-phism markers［J］.Biochemical Genetics，2008，46:162-179.

［17］Budak H，Shearman R C，Parmaksiz I，et al.Comparative analysis of seeded and vegetative biotype buffalograsses based on phylogenetic relationship using ISSRs，SSRs，RAPDs，and SRAPs［J］.Theoretical and Applied Genetics，2004，109:280-288.

［18］Doyle J J.DNA protocols for plants-CTAB total DNA isolation［A］.In:Hewitt G M，Johnston A.Molecular Techniques in Taxonomy［M］.Berlin，Germany:Springer-Verlag，1991:283-293.

［19］Nei M，Li W H.Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences，1979，76:5269-5273.

［20］Mantel N.The detection of disease clustering and a generalized regression approach［J］.Cancer Research，1967，27:209-220.

［21］Yap I，Nelson R J.WinBoot:a program for performing bootstrap analysis of binary data to determine the confidence limits of UPGMA-based dendrograms［C］.Manila，Philippines:International Rice Research Institute(IRRI)，1995.

［22］Felsenstein J.Confidence limits on phylogenesis:an approach using the bootstrap［J］.Evolution，1985，39:783-791.

［23］Rolf J F.NTSYS-pc:Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System，Version 2.1［M］.New York，USA:Exeter Software，Setaukel，2000.

［24］Powell W，Morgante M，Andre C，et al.The comparison of RFLP，RAPD，AFLP and SSR(microsatellite)marker for germplasm analysis［J］.Molecular Breeding，1996，2:225-238.

［25］Schneider S，Roessli D，Excoffier L.ARLEQUIN version 3.1:A Software for Population Genetics Data Analysis［M］.Switzerland:Genetics and Biometry Laboratory，University of Geneva，2006.

［26］Excoffier L，Smouse P E，Quattro J M.Analysis of molecular variance inferred from metric distances among DNA haplotypes:applications to human mitochondrial DNA restriction data［J］.Genetics，1992，131:479-491.

［27］Mizianty M.Variability and structure of natural populations of Elymus caninus(L.)L.based on morphology［J］.Plant Systematics and Evolution，2005，251:199-216.

［28］Díaz O，Sun G L，Salomon B，et al.Levels and distribution of allozyme and RAPD variation in populations of Elymus fibrosis(Schrenk)Tzvel.(Poaceae)［J］.Genetic Resources and Crop Evolution，2000，47:11-24.

［29］馬嘯，周永紅，于海清，等.野生垂穗披堿草種質的醇溶蛋白遺傳多樣性分析［J］.遺傳，2006，28(6):699-706.

［30］Ruiz M，Aguiriano E.Analysis of duplication in the Spanish durum wheat collection maintained in the CRF-INIA on the basis of agro-morphological traits and gliadin proteins［J］.Genetic Resources and Crop Evolution，2004，51:231-235.

［31］Zhang X Q，Salomom B，von Bothmer R.Application of random amplified polymorphic DNA markers to evaluate intraspecific genetic variation in the Elymus alaskanus complex(Poaceae)［J］.Genetic Resources and Crop Evolution，2002，49:397-407.

［32］Sun G L，Díaz O，Salomon B，et al.Genetic diversity in Elymus caninus as revealed by isozyme，RAPD and microsatellite markers［J］.Genome，1999，42:420-431.

［33］Agafonov A V，Baum B R，Bailey L G，et al.Differentiation in the Elymus dahuricus complex(Poaceae):evidence from grain proteins，DNA，and crossability［J］.Hereditas，2002，135:277-289.

［34］Xu D H，Ban T.Phylogenetic and evolutionary relationships between Elymus humidus and other Elymus species based on sequencing of non-coding regions of cpDNA and AFLP of nuclear DNA［J］.Theoretical and Applied Genetics，2004，108:1443-1448.

［35］Zeng B，Zhang X Q，Lan Y，et al.Evaluation of genetic diversity and relationships in orchardgrass(Dactylis glomerata L.)germplasm based on SRAP markers［J］.Canadian Journal of Plant Science，2008，88:53-60.

［36］鄢家俊，白史且，張新全，等.青藏高原老芒麥種質基于SRAP標記的遺傳多樣性研究［J］.草業學報，2010，19(1):173-183.

［37］Hamrick J L，Godt M J W.Conservation genetics of endemic plant species［A］.In:Avise J C，Hamrick J L.Conservation Genetics，Case Histories from Nature［M］.New York:Chapman and Hall，1996:281-304.

［38］孫濤，劉左軍，劉鳳梅，等.鈍裂銀蓮花不同居群遺傳多樣性的ISSR分析［J］.草業學報，2013，22(3):259-265.

［39］Max K H，William C S，Bruce W.The origin of isolating mechanism in flowing plants［A］.In:Max K H.Evolutionary Biology［M］.New York:Plenum Press，1978:185-317.

［40］曾亮，袁慶華，王方，等.冰草屬植物種質資源遺傳多樣性的ISSR分析［J］.草業學報，2013，22(1):260-267.

［41］Johnson R C，Johnston W J，Golob C T，et al.Characterization of the USDA Poa pratensis collection using RAPD markers and agro-nomic descriptors［J］.Genetic Resources and Crop Evolution，2002，49:349-361.

［42］張鐿鋰，李炳元，鄭度.論青藏高原范圍與面積［J］.地理研究，2002，21(1):1-8.

［43］Chen S Y，Ma X，Zhang X Q，et al.Genetic variation and geographical divergence in Elymus nutans Griseb.(Poaceae:Triticeae)from West China［J］.Biochemical Systematics and Ecology，2009，37:716-722.

［44］陳智華，苗佳敏，鐘金城，等.野生垂穗披堿草種質遺傳多樣性的SRAP研究［J］.草業學報，2009，18(5):192-200.

［45］苗佳敏，張新全，陳智華，等.青藏高原和新疆地區垂穗披堿草種質的SRAP及RAPD分析［J］.草地學報，2011，19(2):127-134.

［46］Fu Y B，Peterson G W，Williams D，et al.Patterns of AFLP variation in a core subset of cultivated hexaploid oat germplasm［J］.Theoretical and Applied Genetics，2005，530:530-539.