低氫氰酸含量高丹草新品系及其親本的SSR分析

于卓，謝銳，于肖夏，馬艷紅，李造哲，紀明妹

(內蒙古農業大學農學院，內蒙古呼和浩特010019)

高丹草是高粱(Sorghum bicolor)與蘇丹草(Sorghum sudanense)的種間雜交后代，具有高粱鮮草產量高、抗逆性強和蘇丹草葉量大、品質好等優良特性，其不足點是鮮草中含有氫氰酸［1-3］。有研究表明，高丹草品種間氫氰酸含量差異較大，含量高的品種(株高約100 cm時莖葉鮮草氫氰酸含量≥100 mg/kg)家畜采食量大時會出現中毒現象，給生產帶來嚴重損失［4-6］。選育青刈飼喂安全的超低氫氰酸含量(株高約100 cm時莖葉鮮草氫氰酸含量1～15 mg/kg，青刈后可直接飼喂家畜)高丹草新品種是預防氫氰酸危害的有效措施。

為培育青刈飼喂家畜安全的超低氫氰酸含量高丹草新品種，近年來我們利用在內蒙古中西部地區種植多年的氫氰酸含量低的散穗高粱與黑殼蘇丹草、白殼蘇丹草、紅殼蘇丹草和棕殼蘇丹草相組配進行人工授粉雜交，獲得4個雜交組合的F1代，通過ISSR分子標記輔助選育，得到4個超低氰氫酸含量高丹草新品系SLCN-11(散穗高粱×黑殼蘇丹草F5)、SLCN-12(散穗高粱×白殼蘇丹草F5)、SLCN-13(散穗高粱×紅殼蘇丹草F5)、SLCN-14(散穗高粱×棕殼蘇丹草F5)［7-10］。SSR(simple sequence repeats，簡單重復序列)為共顯性標記，具有多態性豐富、重復性好等優點，已廣泛應用于牧草和作物的遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構建、基因定位及分子標記輔助育種［11-14］。目前，國內外有關SSR標記技術在高丹草品種或品系鑒定方面的應用尚未見有研究報道。本試驗以我們育成登記的高丹草品種蒙農青飼3號為對照［15］，重點對上述4個高丹草新品系及其親本進行SSR分析，以明確其在DNA水平上的差異程度，并建立高丹草新品系的SSR指紋圖，為下一步高丹草新品種育成及登記利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

材料為4個高丹草新品系SLCN-11(散穗高粱×黑殼蘇丹草F5)、SLCN-12(散穗高粱×白殼蘇丹草F5)、SLCN-13(散穗高粱×紅殼蘇丹草F5)、SLCN-14(散穗高粱×棕殼蘇丹草F5)及母本散穗高粱和父本黑殼蘇丹草、白殼蘇丹草、紅殼蘇丹草、棕殼蘇丹草，對照品種為蒙農青飼3號高丹草(Sorghum bicolor×Sorghum sudanense cv.Mengnong Qingsi No.3)。各供試材料的種子由內蒙古農業大學農學院飼用作物育種研究室提供，試驗于2012年7月至2013年5月在室內進行。

1.2 總DNA提取與純度檢測

將各供試材料的種子播種在花盆中，室溫條件下培養成苗，在三葉期每種材料隨機剪取20個單株幼苗的葉片混合，用植物基因組試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取DNA，取5 μL DNA用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度，將各材料的DNA濃度稀釋至50 ng/μL置冰箱中冷凍保存備用。

1.3 SSR-PCR擴增反應

擴增反應體系:反應液總體積為 20 μL，其中 ddH2O 11.6 μL，10 × Buffer 2.0 μL，Mg2+1.6 μL，dNTP 1.6 μL，Taq 酶 0.2 μL，上游引物 1.0 μL，下游引物 1.0 μL，60 ng/μL 的模板 DNA 1.0 μL。

擴增反應程序:在Eppendorf Mastercycler 5331-PCR儀上，95℃變性4 min，1個循環;94℃變性30 s，56℃退火45 s，72℃延伸90 s，34個循環;72℃延伸10 min，1個循環后終止反應。

聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染檢測:擴增產物在6%變性聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳，每樣品點樣8 μL，電泳時間2 h。膠板在0.15%AgNO3溶液中銀染15 min，取出后蒸餾水速漂5 s，放入含有3%NaOH和0.5%甲醛的溶液中顯色10 min，視條帶清晰后轉入固定液終止反應，蒸餾水清洗2 min后晾干、掃描。

1.4 SSR適宜引物的篩選

利用已開發的同屬植物高粱的200對SSR引物進行篩選(http://algodon.tamu.edu/sorghumdb.html提供的引物序列，由上海生物工程公司合成)，選出多態性豐富的適宜引物，用于PCR擴增。試驗重復5次。

1.5 SSR分子標記的數據處理

將染色好的膠板放在透射光燈箱上，記錄膠板上清晰的條帶，電泳結果采取0/1賦值記帶，將所觀察到的每一條帶視為1個單位，有帶記為1，無帶記為0，生成0，1組成的數據矩陣，進行統計分析，并計算下列相關遺傳系數［16］。

多態性位點百分率:對于某一位點而言，當變異個體頻率大于0.01時，該位點即為多態性位點(P):P=(K/N)×100%，式中，K為多態性位點數目、N為擴增位點總數。

供試材料的遺傳相似系數(GS)和遺傳距離(GD):GS=2Sij/(Si+Sj)，式中，Sij為材料i和材料j共有的條帶數目，Si+Sj為2種材料中出現的條帶數目之和;GD=1－GS。根據類平均法，運用DPS V 8.01分析軟件進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 供試材料基因組DNA質量檢測

用植物基因組試劑盒提取10個供試材料基因組DNA的電泳條帶清晰、可辨、均勻且無拖尾現象，表明所提取的DNA純度高，完全能滿足SSR分析的要求(圖1)。

圖1 供試植物基因組DNA電泳檢測Fig.1 The electrophoresis of genomic DNA of tested plants

2.2 SSR 擴增結果

以4個高丹草新品系 SLCN-11、SLCN-12、SLCN-13、SLCN-14和其親本散穗高粱、黑殼蘇丹草、白殼蘇丹草、紅殼蘇丹草、棕殼蘇丹草及蒙農青飼3號高丹草基因組DNA為模板，從200個SSR引物中篩選出條帶清晰、穩定性好、多態性豐富的適宜引物12對(表1)，用于10個供試材料基因組DNA的PCR擴增，共得到576個SSR位點，其擴增片段長度多在200～2500 bp之間，平均每對引物擴增出48個，多態性位點509個，多態性百分率達87.3%。在12對引物中，以引物Xtxp 7擴增的總位點數和多態性位點數最少，分別為26和18個，引物Xtxp 96擴增的多態性位點百分率最高，為100%(表2)。

表1 SSR分析所用引物及其堿基序列Table 1 Primers and their nucleotide sequences used for SSR analysis

此外，每對引物擴增的SSR指紋圖均可以清晰地將10個供試材料區別開來，這可為高丹草新品系鑒定及下一步新品種育成登記和知識產權保護利用提供DNA分子依據(圖2～4)。

表2 供試植物SSR引物及擴增結果Table 2 SSR amplification results of tested plants

2.3 遺傳距離和聚類分析

10個供試材料間的遺傳距離(GD)變幅在0.3165 ～0.6692 之間，平均為0.5359(表3);以 GD 值0.50為基準，10個材料大體分為5類:蒙農青飼3號、散穗高粱、SLCN-11、SLCN-12、SLCN-13 為一類;SLCN-14、棕殼蘇丹草為一類;白殼蘇丹草、黑殼蘇丹草、紅殼蘇丹草各單獨為一類(圖5)。

3 討論

植物遠緣雜交是實現不同物種間基因交流和創造新種質(新物種、新品種)的重要途徑［17-18］。本試驗用育成登記的高丹草品種蒙農青飼3號作對照，將散穗高粱與黑殼蘇丹草、白殼蘇丹草、紅殼蘇丹草和棕殼蘇丹草種間遠緣雜交獲得的4個低氰含量高丹草新品系SLCN-11、SLCN-12、SLCN-13、SLCN-14［9-10］和其親本間的遺傳差異及親緣關系進行SSR分析顯示，各供試材料間的遺傳距離(GD值)平均為0.5359，遺傳差異較大;10個材料聚為3類，其中在第1類的5個材料中，包含了3個母本遺傳背景均為散穗高粱的新品系SLCN-11、SLCN-12和SLCN-13，新品系SLCN-14與其沒有雜交關系的棕殼蘇丹草聚在一起，另外3個父本材料黑殼蘇丹草、白殼蘇丹草和紅殼蘇丹草各單獨為一類，即部分遺傳背景相同或不同的雜交新品系并沒有表現出明顯的聚類規則。這說明高粱和蘇丹草種間雜交育成的新品系實現了親本間基因的復雜交流，打亂了其親本原有的基因次序，組合形成了新的基因型，這可能是高丹草雜交新品系雜種優勢強的重要分子依據。

圖2 引物xtxp61的SSR指紋圖Fig.2 SSR fingerprint amplified by the primers xtxp61

圖3 引物xtxp69的SSR指紋圖Fig.3 SSR fingerprint amplified by the primers xtxp69

圖4 引物ZCT339的SSR指紋圖Fig.4 SSR fingerprint amplified by the primers ZCT339

表3 供試植物的遺傳距離矩陣Table 3 The genetic distance matrix of tested plants

由于高丹草目前還沒有開發出SSR引物，若單獨開發成本高，故本試驗從網上公布 (http://algodon.tamu.edu/sorghumdb.html)的200個普通高粱(近源同屬植物)的SSR引物中，篩選出多態性豐富、條帶穩定的12對引物進行了PCR擴增和位點分析，由于這些引物在普通高粱上擴增的SSR位點數目等表現情況目前還未見有研究報道，尚難與本試驗結果進行比對，但本試驗所用的母本材料散穗高粱是高粱屬的一種，從12對引物擴增的電泳圖片可知，由于引物不同其位點數不同，總體看散穗高粱的SSR位點數較多，它們與其余9個供試材料的SSR位點數和條帶位置存在著一定的差異，而且每對引物擴增的SSR指紋圖均可將10個供試材料區分開來，說明同屬近緣種普通高粱的SSR引物用于高丹草新品系在DNA水平上鑒定是可行的。

本試驗采用植物基因組試劑盒提取各供試植物基因組DNA的質量很高，但在試驗中應注意樣品經液氮處理后要迅速研磨成粉末狀，且要避免長時間放置研好的樣品，否則會影響DNA的提取效果，甚至導致DNA提取失敗。另外，在聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)制備過程中，加速劑TEMED應最后加入，并迅速充分混勻、立即勻速灌膠，否則會導致同一膠板電泳速度不一致，出現非水平的條帶而影響試驗結果。

圖5 10個供試植物的SSR聚類圖Fig.5 The SSR dendrogram of 10 tested plants

4 結論

試驗篩選出SSR適宜引物12對，PCR擴增10個材料的基因組DNA共得到509個多態性位點，多態性百分率達87.30%。每對引物擴增的SSR指紋圖清晰、穩定，是識別4個低氰含量高丹草新品系及其親本的重要分子依據。供試材料間的GD值變幅為0.3165～0.6692，以GD值0.50為基準，10個材料劃分為5類:蒙農青飼3號、散穗高粱、SLCN-11、SLCN-12、SLCN-13為一類;SLCN-14、棕殼蘇丹草為一類;白殼蘇丹草、黑殼蘇丹草、紅殼蘇丹草各單獨為一類。

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