鴨茅品種的SCoT遺傳變異分析

蔣林峰，張新全 ，黃琳凱，馬嘯，嚴德飛，胡強，付玉鳳

(1．四川農業大學動物科技學院草業科學系，四川雅安625014;2．重慶市墊江縣畜牧生產站，重慶408300)

目標起始密碼子多態性(start codon targeted polymorphism，SCoT)，是基于SRAP(sequence-related amplified polymorphism，相關擴增多態性)［1］的一種新型目的基因分子標記技術，其產生的顯性多態性偏向候選功能基因區［2］。主要依據植物基因中ATG翻譯起始位點側翼序列的保守性而設計［3-4］。另外，較高退火溫度的設計有助于減少假陽性擴增的可能性［5］。與其他標記相比，SCoT標記結合了ISSR(inter simple sequence repeat，簡單重復序列間區)［6-7］和RAPD(randomly amplified polymorphic DNA，隨機擴增多態性DNA)的優點，具引物通用性，穩定性好，重復性好等優點，同時能有效產生相關性狀多態，更好地反映物種遺傳多樣性和親緣關系［8］。自2009年開發以來，已有其用于葡萄(Vitis vinifera)［9］、芒果(Mangifera indica)［10］、花生(Arachis hypogaea)［11］、土豆(Solanum tuberosum)［12］等農作物和植物的相關研究報道。但就牧草研究領域，目前僅有SCoT標記用于苜蓿(Medicago sativa)［4］種質遺傳分析的少量報道。

鴨茅(Dactylis glomerata)為禾本科(Poaceae)早熟禾亞科(Pooideae)鴨茅屬(Dactylis)多年生疏叢型禾草［13-14］，是鴨茅亞種中重要的同源四倍體栽培種［15］，起源于歐洲、北非和亞洲溫帶地區［16］，因草質柔嫩、葉量豐富、耐蔭性強、適口性好等優點，在世界各地被廣泛應用于飼草栽培和干草制作［17］，是溫帶和亞熱帶地區重要優良牧草。我國是鴨茅起源地之一，已發現野生鴨茅生長地約26個［18］，可分為二倍體(2n=2x=14)、四倍體(2n=4x=28)及稀有的六倍體(2n=6x=42)3種類型［19］，近年來，鴨茅大量應用于我國草地畜牧業及生態建設，取得了良好的經濟和生態效益。

到目前，我國審定登記鴨茅品種僅為8個，且只有“寶興”、“川東”、“古藺”3個品種通過野生栽培馴化而來，其余5個皆為引進品種，國內鴨茅品種遺傳基礎相對狹窄，引進品種普遍表現出在當地抗性低、適應性差等缺點，難以滿足我國生態治理和畜牧業發展的需求。采用不同的育種方法，綜合選育利用我國豐富的鴨茅種質資源已經刻不容緩。而縱觀全球，國外通過不同的選育目標和育種方式已獲得近500個鴨茅品種，品種適應性強。采用不同的技術手段開展鴨茅種質遺傳研究，對于鴨茅育種具有重要意義。同時，國內外學者對鴨茅的研究已從形態學［20］、細胞學［21］、同工酶［22］深入到分子水平。分子標記因不受環境影響、效率快、分辨率高等優點被廣泛應用。謝文剛等［23］利用SSR(simple sequence repeat，簡單重復序列)對11份鴨茅種質的110個單株遺傳分析表明，我國西南地區鴨茅種質遺傳多樣性豐富，其遺傳變異主要存在于種質內和地理區域內;Peng等［24］利用AFLP(amplified fragment length polymorphism，擴增片段長度多態性)對32份鴨茅分析表明，鴨茅遺傳多樣性與染色體倍性、地理分布等顯著相關;萬剛等［25］對23份鴨茅二倍體、四倍體SSR研究表明，四倍體較二倍體遺傳多樣性更為豐富，是鴨茅品種選育的優良材料。這些研究主要集中于鴨茅野生材料、栽培馴化品種等的研究，但對于鴨茅國內栽培馴化品種與引進品種的遺傳變異對比研究，國內外均未有報道。了解我國現有鴨茅栽培馴化品種的遺傳背景和變異，有助于保證我國鴨茅種質資源的合理利用和豐富我國鴨茅野生馴化栽培馴化品種的遺傳多樣性。

本研究首次利用SCoT標記技術對來自世界4大洲的32個鴨茅品種進行遺傳變異分析，比較栽培馴化品種與引進品種之間的遺傳差異，以期為進一步加快我國鴨茅育種進程和針對性提高鴨茅品種生態適應能力及利用價值等提供理論依據。

1 材料與方法

1．1 試驗材料

供試材料為32個鴨茅品種，包括8個國內栽培馴化品種(系)和24個國外引進品種，均為四川農業大學草業科學系從國內及國外采集和收集而來(表1)，于2012年9月種植于四川農業大學雅安草業科學試驗基地。

1．2 方法

1．2．1 DNA提取 每份種質隨機選取25個單株的幼嫩葉片等量混合，采用Doyle等［26］的CTAB(cetyl trimethyl ammonium bromide，十六烷基三甲基溴化銨)法提取DNA，并用1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計分別檢測其DNA的純度和濃度，合格的樣品保存于－20℃低溫冰箱，實驗開始時，取出部分按照其測得濃度稀釋至10 ng/μL，4℃冰箱保存備用。

1．2．2 SCoT引物篩選 所用80個SCoT引物由澳大利亞Collard和Mackill［3］(SCoT1～SCoT36)及中國廣西農業大學Luo等［5］(SCoT37～SCoT80)提供，引物由上海生工生物技術有限公司合成。PCR所用Mix混合液(含有10×PCR buffer、Mg2+、dNTPs)和Taq酶均購自天根科技生化公司。采用田間形態差異較大的4個品種，即栽培馴化品種“寶興”、引進品種“安巴”、“Chinook”和新品系“YA01472”，對引物進行預先篩選，從中選取擴增條帶清晰且重復性較好的22個SCoT引物，用于供試32個鴨茅品種的進一步PCR擴增(表2)。

1．2．3 SCoT-PCR擴增 本實驗PCR程序參考植物水稻(Oryza sativa)［3］和牧草苜蓿［4］并有所改動，擴增體系優化為15 μL:包括DNA 模板1 μL(10 ng/μL)，引物1．5 μL(10 pmol/μL)，Mix混合液7．5 μL，Taq酶0．4 μL(2．5 U/μL)，ddH2O 4．6 μL。PCR 反應程序為94℃預變性3 min;94℃變性50 s，50℃退火1 min，72℃延伸2 min，36個循環;72℃延伸5 min，最后冷卻至4℃保存。PCR擴增產物在含0．05μL/mL Gelred(10000×水溶液)的1．8%瓊脂糖凝膠中電泳，待溴酚藍電泳至凝膠尾端約1 cm時停止電泳，約需2．5～3．0 h。電泳完畢觀察，再用凝膠成像系統拍照。

1．2．4 數據分析 SCoT是顯性標記，對獲得的清晰可重復的DNA條帶進行統計，在相同遷移位置上將穩定出現的條帶的有或無賦值為1和0進行統計，構成原始數據矩陣。利用軟件Excel 2007和POPGENE 1．31［27］計算多態性條帶百分比(percentage of polymorphic bands，PPB)，Nei氏遺傳多樣性指數(Nei’s gene diversity，H)［28］和Shannon信息多樣性指數(Shannon’s information index of diversity，I)。利用WINAMOVA 1．55對國內栽培馴化品種與引進品種的遺傳變異進行分子方差分析(analysis ofmolecular variance，AMOVA)［29］。POPGENE和AMOVA數據輸入文件均由軟件 DCFA1．1［30］生成。利用軟件 FreeTree［31］基于 Nei-Li［32］遺傳相似系數(genetic similarity，GS)的不加權成對群算術平均法(unweighted pair-group method with arithmetic averages，UPGMA)計算各品種的遺傳距離(genetic distance，GD)，按公式GD=1－GS計算。采用Dendroscope 3［33］構建各品種的聚類樹，利用NTsyspc V2．1［34］進行鴨茅品種的主成分分析(principal coordinate analysis，PCoA)。

表1 供試鴨茅材料名稱及來源Table 1 Names and sources of D．glomerata used in this study

2 結果與分析

2．1 SCoT標記多態性分析

22個引物共擴增出308條清晰可辨條帶，擴增片段大小在250～2000 bp，大部分集中在250～1500 bp(圖1)，平均每個引物擴增條帶數為14條，條帶變化為9條(SCoT8，SCoT9和SCoT20)到19條(SCoT40)，其中，多態性譜帶245條，平均每個引物擴增多態性條帶數為11．14條，多態性比率(PPB)為79．55%，多態性條帶變化為5條(SCoT9，SCoT11和SCoT12)到18條(SCoT65)，表明SCoT標記能檢測到較多的遺傳位點，獲得多態性較好的PCR結果(表3)。

圖1 引物SCoT 23對鴨茅品種的擴增結果Fig．1 Am plified resultsw ith primer No．SCoT 23 on orchardgrass varieties

2．2 供試鴨茅品種遺傳距離(GD)分析

根據0，1原始數據表征矩陣，利用軟件Freetree［31］基于Nei-Li遺傳相似系數得到供試鴨茅品種的遺傳距離，用于分析其相互之間的親緣關系。32份鴨茅品種遺傳距離范圍為0．0251～0．3157，平均遺傳距離為0．1916，其中來自法國的Cristobal和來自捷克的Intensiv遺傳距離最大，表明其之間的親緣關系最遠，來自匈牙利的Georgikon和來自波蘭的Nika遺傳距離最小，表明其親緣關系最近。總體上遺傳距離的差異呈現了不同供試鴨茅品種來源地的分布差異，品種間遺傳差異較大。將所有品種按照育種背景劃分為國內栽培馴化品種和國外引進品種，可以進一步分析2種選育背景下不同鴨茅品種之間的遺傳分化和差異，結果發現栽培馴化品種內部的遺傳距離范圍為0．0601～0．1802，平均遺傳距離為0．1242，其中“寶興”和“川東”遺傳距離最小，其都為國審栽培馴化品種，“YA01472”和“YA02-116”遺傳距離最大，其為鴨茅栽培馴化新品系，表明目前國內登記的鴨茅栽培馴化品種間遺傳相似度較高，新品系“YA01472”和“YA02-116”遺傳多樣性較已經登記的栽培馴化品種(“寶興”、“古藺”、“川東”)有所提高;而引進品種內部的遺傳距離范圍為0．0251～0．3157，平均遺傳距離為0．1952，可見國內栽培馴化品種的遺傳多樣性水平低于引進品種。

2．3 鴨茅類群的遺傳變異比較分析

將32份鴨茅品種劃分為栽培馴化品種類群和國外引進品種類群，比較他們之間的遺傳變異。采用軟件AMOVA 1．55［29］分析其類群之間和之內的方差、方差分量及貢獻率(表 4)，采用 POPGENE version 1．32［27］分析其類群的遺傳多樣性和反應其類群的等位基因豐富度和均勻程度(表5)。分子方差分析(AMOVA)結果表明，16．32%的遺傳變異存在于兩類群之間，兩類群之內的遺傳變異較高，占有83．68%，2種品種類群之間和之內的差異均極顯著(P＜0．001)。此外，供試鴨茅品種類群間的表型預測(Фst)值為0．1630，也說明遺傳結構的變異主要存在于品種類群之內。由表5可知，供試鴨茅品種基因多樣性指數為0．2646，Shannon指數為0．3983。其中引進品種的多態性條帶(NPB)，多態性比率(PPB)，基因多樣性指數(H)，Shannon指數(I)都高于栽培馴化品種，基本代表了鴨茅物種的整體遺傳水平，與2．2中分析的遺傳距離分析結果相符合，說明鴨茅引進品種較目前國內普遍存在的栽培馴化品種有更為豐富的遺傳多樣性和變異水平，這可能是國外品種選育方法和選育材料較為多元化的結果。

2．4 基于Nei-Li遺傳相似系數的聚類分析

利用Freetree［31］軟件計算出供試各鴨茅品種間的Nei氏遺傳一致度和遺傳距離的無偏估計值，然后用Dendroscope 3［33］繪制 UPGMA 聚類圖。總體看來，供試32份鴨茅品種主要可分為6類(圖2)。類群I有8個品種(系)，包括來自中國的3個栽培馴化品種(“寶興”、“古藺”、“川東”)和 5個野生馴化新品系(“YA79-9”、“YA01-103”、“YA02-116”、“YA01175”、“YA01472”);類群II包括3個品種，即來自大洋洲的“Gippsland”、“草地瓦納”和“Akaroa”;類群 VI包括 8個品種，即來自歐洲的“Georgikon”、“Nika”、“Weihenstephaner”、“金牛”、“德納塔”、“大拿”、“Asta”和“Intensiv”;類群 III包括來自南美洲的 3個品種(“Hawk”、“遠航”、“Oron”)及來自歐洲的 6 個品種(“Krasnodarskaya”、“Frode”、“安巴”、“波特”、“斯巴達”、“阿索斯”);其余2個類群(IV和V)包括了來自歐洲的其余供試鴨茅品種。由聚類分析可知，目前國內已經登記的鴨茅栽培馴化品種間具有一定的遺傳相似度，遺傳距離較近，3個品種(“古藺”、“寶興”、“川東”)育成登記時間分別為1995，1999和2003年，可能由當時較為簡單的選育方法、相似的生態地理環境等原因導致，而新品系“YA02-116”較之前栽培馴化品種有所改善，但遺傳變異仍較為狹窄，這與前面的分析結果一致，可能是由于不同生境材料混合采樣及選育過程中混合選擇等原因;而反觀國外選育的品種，其大多數為綜合品種，其同一來源的品種間存在較大的遺傳距離和遺傳差異，但總體上供試品種的聚類與地理分布存在一定的相關性，且其品種繼承了更為豐富的遺傳多樣性和更為一致的群體一致性，利于品種的推廣和應用。

表3 SCoT標記擴增結果Table 3 Amp lified results of SCoT markers

2．5 主成分分析

主成分分析(PCoA)可作為種質聚類分析結果的驗證和對比，同時各種質在主成分分析二維或三維圖上的遠近關系可以更為直觀的反映它們之間的親緣關系和遺傳差異。利用原始矩陣數據基于遺傳相似系數(GS)，用NTsys-pc V2．1［34］軟件對供試32份鴨茅品種進行主成分分析，前3個主成分所能解釋的遺傳變異為46．08%，并根據第一、第三主成分進行作圖(圖3)。主成分結果與聚類分析結果基本一致，整體上顯示出國內的栽培馴化品種(系)，尤其是3個國審鴨茅栽培馴化品種間親緣關系較近，遺傳豐富度和遺傳變異水平較引進品種稍差，通過栽培馴化品種和引進品種遺傳變異的對比，反思目前國內普遍使用的選育手段是否具有代表性、品種遺傳一致度是否較好等問題，對于今后我國的鴨茅新品種選育工作和加快鴨茅育種進程具有一定的指導意義。

表4 鴨茅品種分子變異方差分析(AMOVA)Table 4 Analysis ofmolecular variance(AMOVA)for variety of orchardgrass

表5 2種品種類群遺傳多樣性指數Table 5 Genetic diversity index of two varieties groups

3 討論

3．1 SCoT標記的多態性

SCoT標記是一種基于翻譯起始位點(translation initiation site，TIS)的目標分子標記新技術，具有操作簡單、引物通用性、多態性高、成本低、重復性好等優點［2］，其較多的基因組基因形成了較多的引物結合位點，且其單引物的設計，使得那些較近而又反向結合的引物結合位點之間的片段得以有效擴增。擴增不確定性介于外顯子與內含子之間，大幅度地提升了其引物的多態性［8］。較其他分子標記(AFLP，ISSR，SSR，SRAP，RAPD等)，其與功能基因相關，更能反應相關功能性狀多態［11］，是用于農作物、水果和牧草等植物種質資源鑒定、保護和利用，高密度遺傳連鎖圖譜構建，分子標記輔助育種，基因定位和克隆等研究的非常有效的一種分子標記。

本研究首次將SCoT標記技術應用于鴨茅品種的DNA多態性鑒定，其能在鴨茅品種資源中檢測出較豐富的遺傳多態性，這與鴨茅品種資源間具有較豐富的表型性狀多態性相一致。擴增平均多態性條帶為11．14條，而謝文剛等［23］使用SSR標記對來自中國西南地區鴨茅的遺傳多樣性研究多態性條帶為6．8條，Guo等［9］采用SCoT標記對64份葡萄品種研究的多態性條帶為7．7條，可見SCoT標記能夠產生較多的多態位點用于鴨茅遺傳變異研究。另外，其多態性位點率為79．55%，而Luo等［5］采用SCoT標記對來自中國的50份芒果種質研究的多態性為76．19%，Luo等［35］采用ISSR標記對23份芒果種質分析的多態性為55．77%，熊發前等［8］對花生屬采用與功能基因相關的SCoT研究多態性為31．80%，韓國輝等［2］對柑橘(Citrus)SCoT研究多態性為54．80%，由此可知，SCoT標記可以作為研究鴨茅遺傳多樣性的有效手段，其得到的分子標記極有可能是功能基因的一部分，是進一步開發特定功能基因標記和建立分子標記輔助育種技術體系的基礎。

3．2 鴨茅栽培馴化品種與引進品種遺傳差異

圖2 SCoT標記對32份鴨茅品種親緣關系聚類圖Fig．2 Dendrogram of the relationship UPGMA cluster of 32 orchardgrass varieties based on SCoT markers

本研究采用SCoT標記技術開展鴨茅栽培馴化品種與引進品種的遺傳變異比較，研究表明，國內鴨茅栽培馴化品種平均遺傳距離為0．1242，多態性條帶為135條，基因多樣性指數為0．1596，Shannon指數為0．2383，而鴨茅引進品種的遺傳多樣性從以上幾個水平都遠高于栽培馴化品種，基本代表了鴨茅物種的遺傳變異水平。從側面揭示了目前國內鴨茅品種遺傳基礎狹窄的現狀。通過分子方差分析表明，鴨茅栽培馴化品種和引進品種2個類群的遺傳變異主要還是分布于類群內部，尤其是引進品種內部的不同鴨茅品種間具有更為豐富的遺傳差異。聚類分析和主成分分析的結果基本一致，供試32個鴨茅品種主要可分為6類，其中來自國內的8個栽培馴化品種聚為類群I，進一步印證了目前國內鴨茅栽培馴化品種內部遺傳變異較小的瓶頸。這與萬剛等［25］的研究結果一致，認為3個國內栽培馴化品種(“寶興”、“川東”、“古藺”)間的遺傳變異較為狹窄，可能是緣于3個鴨茅栽培馴化品種采集地相似的自然氣候地理條件和較為傳統的育種方式等原因。

總的來說，就鴨茅栽培馴化品種和引進品種的遺傳分化而言，引進品種和國內栽培馴化品種間差異較大，引進品種的遺傳多樣性更為豐富，而栽培馴化品種相對來說整齊度差，品種結實性差，適應范圍小。究其原因，可能是國外鴨茅育種家在育種方法和育種材料的選擇上，較國內科研單位更為先進和合理，其針對性強，工作延續性強，選育時間長，品種性狀更為穩定。目前采用較多的是選擇在各方面性狀表現較為優良的不同材料，讓其自由傳粉，經過多代選擇和淘汰，并采取一定的育種手段，使優良基因得到穩定遺傳，這樣選育得到的品種具有較為豐富的遺傳多樣性和較大的生境適應能力，及更為穩定的群體一致性。

3．3 鴨茅新品種選育及其利用

圖3 基于SCoT譜型的32份鴨茅品種主成分分析Fig．3 Principal component analysis based on SCoT patterns in 32 orchardgrass varieties

我國是鴨茅的主要起源地之一，具有包括二倍體、四倍體和六倍體的野生鴨茅分布地26個［18-19］，大量的研究表明我國野生鴨茅種質資源遺傳多樣性豐富。謝文剛等［23］對西南區鴨茅種質研究也表明我國鴨茅野生種質資源豐富，保持了較大的變異度和遺傳多樣性;萬剛等［25］對鴨茅栽培馴化品種與野生材料遺傳多樣性的SSR研究分析表明，我國目前推廣應用的鴨茅栽培馴化品種少且遺傳基礎狹窄，而我國的野生鴨茅種質資源具有豐富的遺傳多樣性，可通過開展相關的雜交篩選等工作，選育出能夠滿足我國不同生態條件下的鴨茅品種。Peng等［24］和鐘聲［20］的研究同樣也證明了上述結論。本研究表明，鴨茅引進品種基因多樣性指數等指標都高于栽培馴化品種。同時，目前國外已登記鴨茅品種達500個，在今后我國的鴨茅新品種選育策略上，應更多的針對于不同倍性、抗病、抗旱、葉量、適應性等特性進行雜交親本材料選擇，特別是在鴨茅易感的銹病等癥狀方面，選出在不同特性上表現突出和較弱的材料進行雜交，通過采用較為合理的育種方法，選育出適合我國不同生境生長的鴨茅新品種。另外，鴨茅為高度異花授粉植物［14］，天然的雜交會引起品種內部的分化，對于品種的有效隔離也是一個必不可少的保護措施。

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