高寒草甸魏斯氏乳酸菌的分離鑒定及理化特性研究

楊楊，石超，郭旭生，3*

(1．蘭州大學草地農業科技學院草地農業生態系統國家重點實驗室，甘肅蘭州730020;2．蘭州大學生命科學學院草地農業生態系統國家重點實驗室，甘肅蘭州730000;3．蘭州大學青藏高原生態系統管理國際中心，甘肅蘭州730000)

草地畜牧業作為青藏高原傳統的基礎產業在其經濟發展中具有重要的地位，也是青藏高原今后經濟發展的支柱產業之一。但是，長期以來天然草地飼草料供給的季節性不平衡，嚴重制約著青藏高原草地畜牧業的高效發展，加之長期的超載過牧，草地退化，使草畜矛盾日益突出［1-3］。通過人工種草和天然草地打草來制作青貯飼料，將是解決高寒草地畜牧業冬春季節飼草料嚴重不足的有效措施之一。乳酸菌在飼料工業中，尤其在青貯飼料的制備領域中有著重要的作用。在很多國家特別是歐美等發達國家已經對乳酸菌在青貯飼料制備中的應用進行了大量而深入的研究。其研究內容主要包括性狀優良乳酸菌的篩選，乳酸菌對青貯飼料發酵品質的影響，添加乳酸菌的青貯飼料對奶牛采食量的影響以及乳酸菌對青貯飼料二次發酵的抑制作用等［4］。而在用于飼料青貯的乳酸菌的篩選及其對青貯飼料發酵品質影響的基礎應用研究、產品開發等方面日本和歐美國家處于領先地位，但我國乳酸菌在青貯飼料中的研究主要是利用國外商品化的乳酸菌制劑進行試驗［5-6］，對具有自主知識產權的乳酸菌制劑的研究與開發很少。然而，我國青藏高原地區的極端氣候環境，使得傳統商品化乳酸菌在該地區的應用受到了限制，因為商品化乳酸菌制劑的適宜生長溫度通常為20～25℃。因此，發掘利用高寒地區鄉土乳酸菌種質資源，對于在該地區制作青貯飼料具有重要的意義。

近幾年，有關青藏高原乳酸菌的多樣性與種質資源的研究，逐漸引起了國內外學者的關注，這方面的研究主要涉及食品學科并集中于高原傳統發酵乳制品中乳酸菌的分離與鑒定［7-13］。國內有關牧草中天然附著乳酸菌分離鑒定及其在青貯飼料中的篩選研究與應用方面起步較晚，最近幾年才開始有報道［4，14-16］，而且關于青藏高原高寒地區牧草中附著乳酸菌的研究還無人涉及，只有相關研究表明，在我國高寒地區高海拔、低溫和缺氧的極端環境中進行牧草青貯時能夠得到優質的青貯飼料。青貯飼料色綠，酸香味濃，適口性好，幾乎沒有二次發酵的現象［17-18］。這說明在我國青藏高原高寒地區依然存在著能夠在極端環境中發酵飼料的特殊乳酸菌菌群。在西藏高寒地區，以藏北嵩草(Kobresia littledalei)為優勢種的草地型是全區高寒沼澤化草甸亞類草地中分布范圍廣、面積大、牧草飼用價值較高的草地型［19-20］。因此，本試驗以藏北嵩草為原料，對其附著乳酸菌進行分離、鑒定和生物學特性研究，為篩選青藏高原青貯飼料用優良乳酸菌種質資源提供科學依據。

1 材料與方法

1．1 樣品采集

用于分離乳酸菌的試驗樣品藏北嵩草于2010年7月初分別采自西藏納木錯高寒草甸草地(海拔5100 m;東經90°42'，北緯 29°58');那曲古露鎮高寒草甸(海拔 4582 m;東經 91°37'，北緯 30°50');堆龍德慶的高寒草甸(海拔3980 m;東經90°49'，北緯29°57')。樣品采集地點的氣候屬于高山亞寒帶半干旱季風氣候。試驗地堆龍德慶鄉年均降雨量為444 mm，年均氣溫7℃，年平均日照時數3000 h;納木錯采樣區年平均溫度－0．6℃，年降雨量456．8 mm，年最高溫在7月份，為14．6℃，該地區日照時數2880 h;樣品采集點古露鎮年平均氣溫－1．3℃，年內最高溫度在7月份，為9．1℃，年平均降雨量為421．9 mm，該地區年平均日照時數為2846 h。樣品采集地點牧草生長期為5月中旬至9月底，土壤類型均為高山草甸土。每個采樣點設置10個1 m×1 m樣本框分別進行采樣。

牧草樣品剪取后，裝入塑料袋，冰盒中冷藏，帶回實驗室，－20℃保存，以備附著微生物檢測。

1．2 培養基

試驗用培養基參考凌代文［21］的方法配制。

葡萄糖酵母蛋白胨(GYP)培養基:蛋白胨2 g，酵母提取物5 g，葡萄糖10 g，吐溫－80 0．25 g，MgSO4·7H2O 0．1 g，MnSO40．1 g，FeSO40．1 g，NaCl 5 g，CaCO35 g，加蒸餾水至 1000 mL，調 pH 6．8，121℃滅菌 15 min。

MRS培養基:蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母提取物5 g，葡萄糖20 g，K2HPO45 g，檸檬酸銨2 g，乙酸鈉5 g，MgSO4·7H2O 0．58 g，吐溫 －80 1 mL，MnSO40．25 g，CaCO320 g，瓊脂粉20 g，加蒸餾水至1000 mL，調 pH 6．2 ～6．4，121℃滅菌15 min。不加瓊脂粉即可得到MRS培養液。

PYG培養基:PY基礎培養液內加入1．0 g葡萄糖。PY基礎培養基為蛋白胨0．5 g，胰酶解酪朊0．5 g，酵母提取物 1．0 g，鹽溶液 4．0 mL，蒸餾水 100 mL。其中鹽溶液為無水氯化鈣 0．2 g，MgSO4·7H2O 0．48 g，磷酸氫二鉀 1．0 g，磷酸二氫鉀 1．0 g，碳酸氫鈉 10．0 g，氯化鈉 2．0 g，蒸餾水 1000 mL。

1．3 乳酸菌的分離與純化

在無菌室中，將嵩草樣品剪成1 cm左右的短段，并稱取10 g分別置裝有90 mL滅菌生理鹽水的三角瓶中，常溫搖床4～6 h。用已滅菌的生理鹽水適當稀釋，選2個稀釋度，每個稀釋度取0．1 mL菌種稀釋液滴到GYP(含有碳酸鈣)平板上，用涂布棒將其涂布均勻后，將平板在37℃厭氧培養48 h。之后，根據菌落的顏色、大小、光澤、透明程度等，挑取有透明圈的單菌落，進行革蘭氏染色、油鏡鏡檢和過氧化氫酶試驗，凡是革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶陰性的菌株疑似其為乳酸菌并以劃線的方式在MRS培養基上繼續分離純化培養2次。將純化后的菌株接種到MRS斜面培養基上培養后，在4℃條件下保存備用。

1．4 菌種鑒定

1．4．1 屬的鑒定 按照凌代文［21］、楊潔彬等［22］、東秀珠和蔡妙英［23］介紹的方法，將所有革蘭氏陽性，過氧化氫酶試驗陰性的分離菌株初步鑒定為乳酸菌。之后根據菌種的形態學特征將其分為桿菌和球菌，并根據凌代文［21］的方法進行乳酸菌屬的初步鑒定試驗。

1．4．2 種的鑒定 乳酸菌種的鑒定參考凌代文［21］的方法。通過糖發酵試驗進行乳酸菌種的鑒定，采用杭州天和生化有限公司提供的糖發酵試劑盒。具體方法按照試劑盒的說明進行。

1．4．3 乳酸菌的16S rRNA序列測定 分離的乳酸菌在MRS培養基中培養8 h后進一步純化并進行菌株DNA的提取。DNA提取試劑盒由天根生化試劑(北京)有限公司提供。DNA的提取及純化按照試劑盒使用方法進行。分離單菌DNA做模板，采用引物57 F:5'-AGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和205 R:5'-CTTGTTACGACTTCACCC-3'進行 PCR 擴增;反應系為(50 μL):DNA 模板2 μL，57 F 1 μL，205 R 1 μL，2×Master Mix 25 μL，ddH2O 21 μL。反應程序為:94℃ 30 min;94℃ 30 s，60 ～50℃，30 s(每個循環降 1℃)，72℃ 1．5 min，10 個循環;94℃30 s，50℃30 s，72℃1．5 min，30個循環;72℃5 min。PCR純化產物進行測序(北京博邁德科技發展有限公司)。

1．5 生長特性檢測

1．5．1 乳酸菌生長速率的測定 用待測菌株的培養液，以相同的接種量(0．1 mL)接入MRS液體培養基中，于30℃厭氧培養箱中培養24 h，每隔2 h取樣品，用紫外可見分光光度計(日立，U-2910)以培養基為空白，在波長620 nm下立即測定樣品的吸光度值，并按照下列公式計算菌株的生長速率。

菌株的生長速率=液體培養基各時間點的OD值－液體培養基的起始OD值。

1．5．2 乳酸菌產酸速率測定 將待測菌液分別接種于MRS液體培養基中，于30℃厭氧培養箱中培養24 h，每隔2 h取樣品，用pH計(上海精科，PHS-3C)檢測培養液pH值，并按照下列公式計算菌株的產酸速率。

產酸速率=培養基中起始pH－各時間點pH。

1．5．3 不同溫度條件下生長特性 將配制好的MRS培養液以5 mL量分裝試管，121℃高壓滅菌15 min，將試驗菌株以相同的接種量(0．1 mL)接入培養液中，搖勻，塞子封口，各設2個重復，溫度為4℃放在冰箱中，10，15，25，30℃放在恒溫培養箱中，40，50，60℃的放在水浴鍋中分別培養，其中4℃培養14 d，40，50和60℃培養7 d，其余培養2 d，觀察菌株的生長情況。

本節將驗證PUs與SUs同時存在于CRN時，幾種頻譜資源分配算法性能對比.在網絡中部署4個PUs，分別位于(30,30)(30,70)(70,30)和(75,30)處，干擾半徑均為30m，以概率θ分別對信道1、2、3和1獨占使用，則信道空閑概率為μ=1-θ.

1．5．4 不同pH條件下生長特性 所用培養基是將MRS培養液用鹽酸或氫氧化鈉調pH至所需酸堿度，即pH分別為3，4，4．5，5，6，7，8，9，9．5 的 9 種 MRS 液體培養基，同上步驟，將試驗菌株的培養液，以相同的接種量(0．1 mL)接入裝有已滅菌培養基中，各設2個重復，置于37℃恒溫培養箱培養2 d后，觀察菌株的耐酸堿能力。

1．6 數據統計分析

不同乳酸菌菌株生長速率及產酸速率利用SPSS 19．0進行單因素方差分析和多重比較。根據乳酸菌的16S rDNA序列，在Genbank中進行比對，分析相似性。乳酸菌16S rRNA序列用MEGA 5．0中的Clustal W對最近類群的序列進行多重比較分析，并通過該軟件的鄰近法(Neighbor-Joining)構建系統發育樹，分支聚類的穩定性用Bootstrap方法進行100次隨機重復取樣評價［13］。

2 結果與分析

2．1 藏北嵩草分離魏斯氏乳酸菌的16S rRNA基因序列分析

采用16S rRNA測序結果表明(表1)，從西藏德慶、那曲古露和納木錯高寒草甸藏北嵩草中共分離出17株魏斯氏乳酸菌。其中從德慶、那曲古露及納木錯藏北嵩草中各分離出9，3及5株菌。這些菌種屬于魏斯氏乳酸菌的2個種，即食竇魏斯氏乳酸菌(Weissella cibaria)和融合魏斯氏乳酸菌(Weissella confusa);而且有10個菌株與Genbank中的標準菌株食竇魏斯氏菌II-I-59(W．cibaria II-I-59)和融合魏斯氏菌JCM 1093(W．confusa JCM 1093)的相似率均為99%。通過進一步對2種魏斯氏乳酸菌菌種相似菌株的16S rRNA基因序列進行多重比較分析和系統發育樹的構建(圖1)，鑒定出所分離的17株魏斯氏乳酸菌菌株有6株為食竇魏斯氏乳酸菌，11株為融合魏斯氏乳酸菌菌株。

2．2 藏北嵩草分離魏斯氏乳酸菌的生長特性

不同海拔地區藏北嵩草附著魏斯氏乳酸菌的生長特征見表2。從分離菌株在不同溫度的生長情況來看，這些菌株均能夠在4和10℃生長。在不同pH值條件下的生長情況表明，菌株D7，D9和N2，N3，N4能在pH值為3的條件下生長，而且大多數菌株能在pH值為4～9．5的范圍內生長。

分離乳酸菌的糖發酵試驗結果見表3。從表3看出，除了菌株N2外，所有的菌株都發酵阿拉伯糖。發酵半乳糖的結果表明，有15個魏斯氏菌株可發酵利用半乳糖，而菌株D2和D7為可變的反應。所有的菌株均能利用纖維二糖，麥芽糖，果糖，蜜二糖和蔗糖。菌株D4，G3，以及N2～N5均能發酵核糖，而菌株D1，D2和D9不利用核糖，其余菌株為可變的反應;從利用棉籽糖的情況來看，菌株D6，N1，N2，N3不發酵棉籽糖。根據魏斯氏乳酸菌的糖發酵鑒定方法，食竇魏斯氏乳酸菌發酵阿拉伯糖，不發酵半乳糖和木糖。但本試驗中所分離菌株的糖發酵試驗結果表明，只有菌株D7利用半乳糖為可變反應，其余5株食竇魏斯氏乳酸菌(D3，D8，D9，N1，N3，N4)均能發酵利用半乳糖。而16S rRNA序列分析結果表明，菌株D2，D4，D5，D6及G1，G2和N2，N3與融合魏斯氏乳酸菌的相似性均為100%，并結合系統發育分析結果(圖1)，菌株D1，D8和G2均為融合魏斯氏乳酸菌。

表1 藏北嵩草附著魏斯氏乳酸菌菌株的16S rRNA基因序列分析結果Table 1 Results of 16S rRNA gene sequences of strain isolated from K．littledalei

2．3 藏北嵩草分離魏斯氏乳酸菌的產酸及生長特性

藏北嵩草附著魏斯氏乳酸菌的產酸速率見表4。17株魏斯氏乳酸菌培養6 h后，菌株D4的產酸速率最快，其培養基中pH比起始培養基的pH下降了1．38，且顯著高于其他菌株的產酸速率(P＜0．05)。培養12 h后，菌株G1培養基中的pH最低，比起始pH降低了2．09，且顯著高于其他菌株的產酸速率(P＜0．05)。培養18 h后，菌株N1培養基中的pH最低，顯著高于其他菌株的產酸速率(P＜0．05)，且比起始pH降低2．46。同時，該菌株在培養24 h后，其產酸速率也最大。

圖1 藏北嵩草分離魏斯氏乳酸菌的系統發育分析Fig．1 The phylogenetic analysis of the Weissella lactic acid bacteria isolated from K．littledalei

3 討論

魏斯菌屬(Weissella)是1993年Collins等提議建立的一個新菌屬，目前至少由12個菌種組成［24］。該乳酸菌不形成芽孢，無動力的革蘭陽性球菌或球桿菌，呈單個、成雙或短鏈狀排列。這類乳酸菌廣泛分布于發酵食物(如臘腸、泡菜)、土壤等，多數菌種在植物發酵中起重要作用［24］。在青貯飼料中報道的魏斯氏菌主要為類腸膜魏斯菌(W．paramesenteroides)，并在青貯飼料發酵初期起重要作用，但研究表明這類乳酸菌在提高青貯飼料品質方面作用較小［25］。

表2 藏北嵩草附著魏斯氏乳酸菌在不同溫度和pH條件下的生長特性Table 2 G row th profiles of Weissella strains isolated from K．littledalei at different tem perature and pH

表3 藏北嵩草附著魏斯氏乳酸菌的糖發酵特性Table 3 Sugar fermentation profiles of Weissella strains isolated from K．littledalei

魏斯菌屬細菌可分離于多種來源。但在高寒極端環境中分離的魏斯氏乳酸菌還未見報道。本研究從高寒地區藏嵩草中分離的魏斯氏乳酸菌，通過16S rRNA序列分析表明，主要為食竇魏斯氏乳酸菌和融合魏斯氏乳酸菌。從目前的研究資料來看，僅見這2種菌分離于人類或其他動物的報道［26-27］。研究表明，這2種菌很難從形態特征及菌落特征方面區別;食竇魏斯氏菌發酵阿拉伯糖，不發酵半乳糖和木糖，可區別于融合魏斯氏菌［24］，因為融合魏斯氏菌不發酵阿拉伯糖、蜜二糖和棉籽糖，但發酵半乳糖、纖維二糖、麥芽糖、核糖等［21］。但本試驗的研究結果表明，從藏嵩草中分離的融合魏斯氏菌除了菌株N2外，其他菌株菌發酵阿拉伯糖，而且分離鑒定的食竇魏斯氏乳酸菌均能利用半乳糖。這可能是高寒環境中魏斯氏乳酸菌對碳源的利用比其他環境中分離出的菌種更具有廣泛性。

由于青藏高原高寒環境的特殊性，從藏嵩草中分離的乳酸菌能夠在4℃的條件下生長，而且在10℃時生長活力旺盛，體現出高寒環境中分離出的乳酸菌對低溫的適應特性。這對高寒低溫條件下，應用分離出的耐低溫乳酸菌進行青貯飼料的發酵提供了保障和科學依據，對于低溫環境中青貯飼料的調制具有重要的意義。另外，本試驗結果表明，菌株D7，D9和N2，N3，N4能在pH為3的條件下生長，體現出這些菌株具有強的耐酸性能力。從本試驗分離出的17株融合魏斯氏乳酸菌的生長特性及產酸能力來看，菌株D4和G1分別在培養6和12 h時，產酸

速率顯著高于其他菌株，可作為飼料青貯時，青貯飼料發酵啟動菌株的備選菌株。而菌株N1在培養18至24 h后，其產酸速率均顯著高于其他菌株。這一特性將對青貯飼料后續發酵起到重要的作用。上述菌株的產酸速率特性，可為青貯飼料發酵菌株的科學合理配伍提供依據。而從生長速率來看，所分離的菌株與其產酸能力并不對應。說明生長速率快的菌株，其產酸能力不一定強。為此，在篩選飼料青貯用乳酸菌菌株時，應以產酸速率為依據。

表4 藏北嵩草附著魏斯氏乳酸菌的產酸速率Table 4 Acid production rate of Weissella strains isolated from K．littledalei

表5 藏北嵩草附著魏斯氏乳酸菌的生長速率Table 5 Grow th rate of Weissella strains isolated from K．littledalei

4 結論

本試驗首次報道了從牧草(高寒藏北嵩草)中分離出魏斯氏乳酸菌。分離出的融合魏斯氏乳酸菌菌株具有耐低溫，耐酸性強，發酵碳源廣泛的特征。這一結果對于今后在我國青藏高原高寒環境中分離具有特殊發酵性能的乳酸菌以及利用這些乳酸菌菌株進行低溫環境中青貯飼料的調制提供了重要的科學依據。本試驗分離魏斯氏乳酸菌菌株對青貯飼料發酵模式及品質的影響將做進一步研究。

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