中國木霉新記錄種俄羅斯木霉的分離鑒定及對馬鈴薯干腐病菌和黑痣病菌的拮抗作用

崔巖，王蒂 ，柴兆祥* ，李金花* ，余斌

(1．甘肅農業大學草業學院，甘肅蘭州730070;2．甘肅省作物遺傳改良與種質創新重點實驗室，甘肅蘭州730070;3．甘肅省干旱生境作物學重點實驗室，甘肅蘭州730070)

馬鈴薯(Solanum tuberosum)是世界第四大糧食作物［1］，也是重要的飼用作物。馬鈴薯的地上莖葉和地下塊莖可以直接作為飼料使用，馬鈴薯加工過程中的薯皮、薯渣也大量用作飼料。

甘肅是馬鈴薯種植大省。近年來，隨著對馬鈴薯需求的不斷增加，種植面積持續擴大，馬鈴薯連作栽培在甘肅已很普遍。據報道，連作可導致作物生長發育不良、品質及產量下降、抗病能力降低［2］。已有研究結果顯示，隨著馬鈴薯連作年限的增加，馬鈴薯根際土壤中鐮刀菌數量呈上升趨勢［3］。由鐮刀菌(Fusarium spp．)引起的干腐病和立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)引起的黑痣病已成為甘肅馬鈴薯生產的主要問題［4-5］，其中干腐病由茄病鐮刀菌(F．solani)和接骨木鐮刀菌(F．sambucinum)等病原所致［4-9］，亟待研究解決。

利用有益微生物和微生物代謝產物是防治農作物病害的有效防治技術與方法［10］。微生物是土壤生態系統的重要組成部分［11-12］。在農業生態系統中，耕作層及作物根圍土壤中具有豐富的微生物類群，不乏一些有益微生物資源。木霉屬(Trichoderma)真菌是土壤習居菌的主要成員，其中很多木霉菌種對土傳病原真菌具有較強的拮抗作用，廣泛應用于土傳植物病害的生物防治中［10，13］。土壤中的木霉還能促進植物生長和加速有機氯等農藥的降解［13］。因此，木霉菌成為世界各國植物病害防治中應用最廣泛的生防菌之一。

為發掘馬鈴薯連作田已有的木霉菌資源，獲得對馬鈴薯干腐病和黑痣病等土傳病害具有生防作用的木霉菌資源，我們從馬鈴薯連作田根際周圍耕作層土壤中分離獲得的一株木霉菌株，通過培養特性觀察和形態學研究，結合rDNA－ITS序列分析進行了鑒定，明確了該菌種對馬鈴薯干腐病菌和黑痣病菌的拮抗作用，為開發利用木霉菌資源和馬鈴薯土傳病害的生物防治提供了依據。

1 材料與方法

1．1 土樣采集

2011年7月，從甘肅國營條山農場馬鈴薯連作試驗田以五點取樣法采集馬鈴薯植株周圍0～20 cm耕作層土樣，采集的土樣混合均勻后裝入無菌袋中并編號，帶回實驗室在－20℃冰箱中保存備用。

1．2 木霉菌的分離純化

1．2．1 供試培養基 1/4馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(1/4PDA):馬鈴薯50 g、葡萄糖4．5 g、瓊脂17 g、水1000 mL，倒平板前加入氯霉素0．01%，丙酸鈉10 mmol/L;馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA):馬鈴薯200 g、葡萄糖17 g、瓊脂17 g、水1000mL;水瓊脂培養基(WA):瓊脂17 g、水1000mL;麥芽浸膏瓊脂培養基(MA):麥芽浸粉30 g、大豆蛋白胨3 g、瓊脂15 g、水1000 mL;馬鈴薯葡萄糖培養液(PDB):馬鈴薯200 g、葡萄糖16 g、水1000 mL。

1．2．2 木霉菌的分離、純化與保存 在無菌條件下，采用稀釋平板分離法進行木霉菌菌株的分離［14-15］。取充分混勻的土樣小樣與無菌蒸餾水按照1∶19的比例加入無菌三角瓶中，振蕩使土樣與無菌水充分混勻，并將土壤懸浮液逐級稀釋為10－1，10－2，10－3g/mL的濃度。根據預試驗結果，取10－3g/mL濃度的土壤懸浮液0．5 mL注入1/4PDA培養基平板上，迅速推平，于25℃恒溫培養。每個土樣重復20個平板。培養5 d后，挑取菌落特征與木霉菌相似的菌落于PDA平板上純化，獲得編號為GAU1-X-2的一株菌株。將純化后的菌株于WA培養基平板上保存備用。

1．3 GAU1-X-2木霉菌株的鑒定

1．3．1 培養性狀觀察 在無菌條件下，將活化后的GAU1-X-2木霉菌株在PDA平板活化后，用6 mm打孔器打成菌餅，分別接種于PDA培養基和MA培養基平板中央，重復3次。25℃恒溫黑暗條件下培養，逐日觀察待鑒定菌株在兩種培養基平板中的菌落形態、氣生菌絲狀況、顏色變化、色素形成等，以48 h的菌落平均直徑計算日生長速率。

1．3．2 顯微形態觀察 在菌落開始生長到菌落顏色出現明顯變化期間，逐日挑取培養物制片，觀察菌絲、分生孢子梗和瓶梗等形態學特征，參照有關資料對GAU1-X-2菌株進行形態學分類鑒定［16-19］。

1．3．3 分子鑒定 DNA提取:將活化后的GAU1-X-2木霉菌株接種在PDB培養液中，25℃、120 r/min，振蕩培養48～72 h，收集菌絲，用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法提取木霉基因組DNA［20］，通過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量。

ITS－PCR擴增和測序分析:用轉錄延伸因子EF-1α基因的引物對EF1-728F、EF1-986R［21］進行PCR擴增，引物由上海生工合成。引物對序列為:EF1-728F(5-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3')和 EF1-986R(5-TACTTGAAG-GAACCCTTACC-3')。PCR反應包括:2×Master PCR Mix 25μL，10μmol/L的引物1μL，模板DNA 1μL，ddH2O加至50μL。PCR擴增條件為:預變性94℃ 4 min;94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，進行35個循環;72℃延伸10 min，4℃保存。PCR擴增產物于1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，用成像系統成像，并送上海生工公司測序。

序列同源性比較和聚類分析:將待測木霉菌株的測序結果與GenBank核苷酸數據庫中的序列進行檢索比對(BLAST)，利用DNAstar軟件將待測菌株的序列與GenBank中比對后同源性不低于95%的登記菌株的序列進行多序列同源性分析，鄰接法構建系統發育樹。

1．4 GAU1-X-2對馬鈴薯塊莖的接種試驗

1．4．1 供試品種及來源 選用5個馬鈴薯品種的塊莖進行木霉菌株GAU1-X-2對馬鈴薯塊莖致腐能力影響的研究。5個品種分別為費烏瑞它(Favorite)、隴薯3號、隴薯6號、青薯2號、青薯9號，其塊莖均由甘肅條山農場提供。

1．4．2 接種及評價方法 以GAU1-X-2木霉菌株培養物接種不同馬鈴薯品種的塊莖，以該菌株對馬鈴薯塊莖有無致腐能力為依據評估GAU1-X-2木霉菌株對馬鈴薯塊莖的影響。具體接種方法參考李金花等［4］的進行:將新鮮健康的5個馬鈴薯品種的塊莖分別用清水沖洗，用75%的酒精擦拭其表面，消毒3 min后，從塊莖表面從上往下切取一四面體，將在PDA上培養72 h的GAU1-X-2木霉菌株打成直徑為6 mm的菌餅，置于切開的底部穴窩中，再蓋上四面體塊莖組織，以接種PDA培養基圓片為空白對照，每個馬鈴薯品種重復3個塊莖。處理塊莖置于25℃、相對濕度90%的恒溫恒濕培養箱中培養，7 d后觀察馬鈴薯塊莖接種部位是否有腐爛出現。若接種菌株不能導致馬鈴薯塊莖穴窩中出現腐爛，且與空白對照一致，則認為所接木霉菌株對馬鈴薯無致腐能力，視為對馬鈴薯安全;反之，若接種部位出現腐爛，則認為所接木霉菌株對馬鈴薯有致腐能力，為不安全。

1．5 GAU1-X-2對馬鈴薯干腐病菌和黑痣病菌的拮抗作用

1．5．1 供試靶標病原菌 供試靶標病原菌菌株4株，分別為1株茄病鐮刀菌(F．solani，編號為FSI)菌株、1株接骨木鐮刀菌(F．sambucinum，編號為FSM)菌株和2株立枯絲核菌(R．solani，編號為RS1和RS2)菌株，所有病菌菌株均分離于馬鈴薯干腐病與黑痣病塊莖，其中菌株RS2由澳大利亞悉尼大學惠贈，其余3株由甘肅農業大學植物病理學實驗室提供。

1．5．2 拮抗作用測定方法 采用對峙培養法進行。將PDA上培養4 d的GAU1-X-2木霉菌株和靶標病原菌分別用打孔器打成直徑為6 mm的菌餅，將木霉菌菌餅和病原菌菌餅分別接種在新的PDA平板兩側，兩菌餅相距4 cm，以只接病原菌不接木霉菌為對照。每處理重復5次。所有處理在25℃恒溫培養5 d后，觀察記錄木霉菌和病原菌的菌落半徑，計算拮抗系數［15，22］。

拮抗系數=(對照靶標病原菌菌落半徑－對峙培養的靶標病原菌菌落半徑)/對照靶標病原菌菌落半徑

2 結果與分析

2．1 鑒定結果

根據純培養菌落特性、分生孢子梗和瓶梗的形態學特征以及ITS序列，將菌株GAU1-X-2鑒定為俄羅斯木霉(T．rossicum)，這是我國首次發現并報道該菌種，為我國新記錄種［16-19］。

2．1．1 培養特性及形態學特征描述 菌株GAU1-X-2在PDA培養基上可產生氣生菌絲，菌落正面絨毛狀至氈狀，背面反面灰白色，在PDA平板的邊緣能快速形成灰綠色至暗綠色產孢區;在MA培養基上常不產生氣生菌絲，但也有能產生的，菌落正面絨氈狀，背面反面暗黃色，后期在MA平板邊緣形成顏色較淺的淡綠色產孢子區(圖1)。在25℃下，在MA和PDA上的菌落日平均生長速度分別為21．0和24．0 mm/d。

分生孢子梗寬且直，初次分枝一般成對或者3個排列為輪枝狀，再次分枝不規則;分枝末端著生瓶梗的細胞為短圓柱形或稍微膨大;瓶梗常在最后一次分枝上形成，很少單生，安瓿形，瓶梗排列緊密;分生孢子橢圓形至短圓柱形，兩端圓;菌絲有融合現象(圖1)。

根據菌株GAU1-X-2的培養特性和形態特征，確定其分類地位為半知菌亞門絲孢綱絲孢目粘孢菌類的木霉屬真菌。

2．1．2 分子鑒定 用CTAB法提取的菌株GAU1-X-2的基因組DNA用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量，得到比較單一的條帶，電泳條帶明亮，帶型較寬，DNA含量較高(圖2)。經PCR擴增后得到大小為300 bp左右的片段(圖3)，由上海生工測序后菌株GAU1-X-2得到了大小為301 bp的堿基序列。

將測序得到的序列與GenBank核苷酸數據庫中已有的木霉菌ITS序列進行比對，菌株GAU1-X-2與GenBank上登錄號為 HQ342222(T．rossicum)、JN133575(T．rossicum)、HQ342224(T．barbatum)、AY937424(T．rossicum)的菌株同源性均達98%，與登錄號為EU280062(T．rossicum)、EU280064(T．rossicum)、EU280066(T．rossicum)、AY937441(T．rossicum)的同源性達95%。

將以上GenBank核苷酸數據庫中的參比菌株和篩選到的菌株GAU1-X-2的序列用DNAStar軟件繪制聚類分析圖。結果表明，菌株GAU1-X-2與登錄號為EU280062(T．rossicum)位于聚類圖的同一分枝，聚為一類(圖4)。

綜合GAU1-X-2木霉菌株的培養特性、形態學特征和分子鑒定結果，將馬鈴薯連作田土壤中獲得的菌株GAU1-X-2鑒定為俄羅斯木霉(T．rossicum)，為我國木霉新記錄種。

2．2 GAU1-X-2對馬鈴薯塊莖的接種結果

將俄羅斯木霉菌株GAU1-X-2分別有傷接種5個馬鈴薯品種的塊莖來檢測該菌株對馬鈴薯塊莖的致腐能力，結果顯示:菌餅接種馬鈴薯塊莖7 d后，接種GAU1-X-2菌株的塊莖其接種部位與對照一致，沒有出現因為致病而導致的腐爛和霉層形成，證明俄羅斯木霉菌株GAU1-X-2對馬鈴薯塊莖無導致腐爛的能力，是安全的。

2．3 GAU1-X-2對馬鈴薯干腐病和黑痣病菌的拮抗作用

圖1 菌株GAU1-X-2的菌落及形態特征Fig．1 Characteristics of the colony on media and them orphology of GAU1-X-2 isolate

以俄羅斯木霉菌株GAU1-X-2為拮抗待測菌株，以分離于馬鈴薯干腐病與黑痣病塊莖的1株茄病鐮刀菌(F．solani)菌株、1株接骨木鐮刀菌(F．sambucinum)菌株和2株立枯絲核菌(R．solani)菌株為靶標病原菌，采用對峙培養法在PDA平板上培養，結果表明，俄羅斯木霉菌株GAU1-X-2對馬鈴薯鐮刀菌干腐病的優勢病菌茄病鐮刀菌(F．solani)和接骨木鐮刀菌(F．sambucinum)的拮抗系數為0．70，對2株馬鈴薯黑痣病菌立枯絲核菌(R．solani)的拮抗系數分別為0．71和0．77，說明俄羅斯木霉菌株GAU1-X-2對兩種馬鈴薯病害的4株病原菌均有較好的拮抗作用。

圖2 菌株GAU1-X-2基因組DNA凝膠電泳圖Fig．2 The agarose gel electrophoresis of DNA of GAU1-X-2

圖3 菌株GAU1-X-2基因組DNA PCR擴增產物凝膠電泳檢測圖Fig．3 The agarose gel electrophoresis of PCR products of GAU1-X-2

圖4 基于rDNA ITS序列的菌株GAU1-X-2的系統發育樹Fig．4 Phylogenetic tree based on rDNA-ITS sequence of isolate GAU1-X-2

3 結論與討論

木霉菌(Trichoderma spp．)為世界性分布。傳統上，木霉被認為是一類典型的土壤真菌［23］。雖然個別木霉菌可以引起蘑菇污染和人類的病害［18］，但大多木霉菌因其強大的生態競爭能力和對許多病原菌的抑制作用而被認為是有良好應用價值的生防菌，備受世界各國的廣泛關注和研究，并作為生防因子用于防治多種作物病害［18，23-24］。我國幅員遼闊，地理氣候和環境條件復雜多樣，蘊藏著豐富的木霉菌生防資源，目前國內已報道的木霉種有 25 種［18］。

本研究在開展甘肅馬鈴薯連作田土壤中木霉菌資源調查的研究中，對獲得的一株木霉菌株GAU1-X-2利用培養特性、形態特征和分子鑒定技術相結合將其鑒定為俄羅斯木霉(T．rossicum)。這是在我國首次分離到該菌種，為中國新記錄種。該種屬于木霉中的Pachybasium組、Clade Stromaticum進化枝，最早從俄羅斯的蘋果園土壤中分離到，目前僅在個別國家有報道［19，25］。

木霉菌傳統的分類鑒定一般通過形態學來進行，但有些木霉種為介于已確定的種與種之間的中間類型，部分種之間在形態上又存在相似性，這給木霉的鑒定和分類帶來很大困難。傳統的分類學研究強調各分類單位在生殖結構上的分化特征和形態上的異同，當木霉菌物是無性個體時，種間的區分界限很難確定［17］。目前木霉的分類和鑒定工作主要是通過形態學特征和核酸序列分析相結合來進行［18］。

利用木霉菌對植物病害進行生物防治在國內外已有很多報道。本研究獲得的俄羅斯木霉(T．rossicum)GAU1-X-2菌株系從馬鈴薯連作田土壤中分離得到，為確定其對馬鈴薯生產的安全性和生防價值，分別進行了GAU1-X-2菌株對馬鈴薯塊莖的致病性測定和對來源于甘肅馬鈴薯鐮刀菌干腐病的兩種優勢病原菌和黑痣病菌的拮抗試驗，結果表明該菌株對馬鈴薯塊莖無致害作用，證實俄羅斯木霉(T．rossicum)GAU1-X-2菌株對馬鈴薯安全;同時，菌株GAU1-X-2對靶標病原菌的拮抗作用明顯，拮抗系數均較高，有很好的生防利用價值。查閱文獻，發現有關于俄羅斯木霉(T．rossicum)對核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)引起的病害的防治作用的報道［26］，但未見對接骨木鐮刀菌(F．sambucinum)、茄病鐮刀菌(F．solani)、立枯絲核菌(R．solani)的拮抗作用的研究報道。

關于俄羅斯木霉(T．rossicum)GAU1-X-2菌株對靶標病原菌的拮抗機制及利用仍待進一步研究。

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